Mutational analysis of molecular interactions between Dbp5 and Gle1 from Debaryomyces hansenii = Debaryomyces hansenii 유래 Dbp5와 Gle1의 돌연변이를 이용한 분자 상호작용 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

mRNA export is an essential cellular process that links transcription and translation in eukaryotes and is mediated through the nuclear pore complex (NPC). This process involves the ATP- and IP₆-dependent function of the Dbp5-Gle1-Nup159 complex, with the activation of the DEAD-box helicase Dbp5 and subsequent RNA remodeling playing critical roles. However, the molecular mechanism regulating the formation of the Gle1-Dbp5 complex in fungi remains unclear. In this study, we investigated the structural and functional characteristics of the interaction between Gle1 and Dbp5 derived from Debaryomyces hansenii. N-terminal truncation and point mutation variants of Dbp5 and Gle1 were generated, and their complex-forming ability was quantitatively assessed using size- exclusion chromatography and integrated density analysis based on SDS–PAGE. The results showed that progressive truncation of the N-terminal region of Dbp5 significantly increased its binding affinity to Gle1. These findings suggest that the N-terminal region of Dbp5 may contribute to the regulation of complex formation and support a cofactor-dependent activation model that differs from the auto-inhibitory helix-mediated mechanism observed in the human homolog DDX19. This study contributes to understanding the mechanism of fungal mRNA export and may inform studies on RNA metabolism and nucleocytoplasmic transport in eukaryotes. Key Words : Dbp5, Gle1, Gle1-Dbp5 complex, Auto-inhibitory helix, DEAD-box helicase, Nuclear pore complex (NPC), mRNA export, Debaryomyces hansenii

국문 초록 (Abstract)

mRNA 방출은 진핵생물에서 전사와 번역을 연결하는 핵심 과정으로, 핵공복합체를 통한 선택적 이동을 통해 이루어진다. 이 과정에는 ATP 및 IP₆ 의존적으로 작용하는 Dbp5, Gle1, Nup159 복합체가 관여하며, 특히 DEAD-box 헬리케이스인 Dbp5 의 활성화와 RNA 리모델링이 필수적이다. 그러나 진균에서의 Dbp5-Gle1 복합체 형성 및 조절 메커니즘은 아직 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 Debaryomyces hansenii 유래 Dbp5 와 Gle1 간의 상호작용에 대한 구조적 및 기능적 특성에 대한 이해도를 높이고자 하였다. Dbp5 와 Gle1 의 N-말단 절단체 및 점돌연변이체를 제작한 후, 크기 배제 크로마토그래피와 SDS–PAGE 기반 통합 밀도(IntDen) 분석을 통해 Dbp5-Gle1 복합체 형성 능력을 정량적으로 비교 분석하였다. 그 결과, Dbp5의 N-말단 영역을 점진적으로 절단함에 따라 Gle1 과의 결합 친화도가 유의미하게 향상되는 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 Dbp5 의 N-말단이 Gle1 과의 복합체 형성에 있어 영향을 줄 수 있다는 점을 강조함과 동시에 인간 상동체인 DDX19의 auto-inhibitory helix 조절 메커니즘과는 다른 보조 인자 의존적 활성화 모델을 제시한다. 이를 통해 진균 mRNA 방출 경로의 세부 메커니즘을 규명하는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구는 다양한 생물 종에서 RNA 방출을 조절하는 분자적 기반을 비교 연구하는 데 있어 참고 자료가 될 수 있으며, 향후 RNA 대사 및 핵-세포질 수송과 관련된 진핵세포 생리 연구의 확장에도 기여할 수 있을 것으로 전망된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and methods 9
• 2.1. Mutagenesis of Gle1 and Dbp5 9
• 2.2. Purification of truncated and site-directed mutant of Gle1 and Dbp5 11
• 2.3. Prediction of three-dimensional structure 12
• 2.4. Protein-protein interaction analysis using size-exclusion chromatography 13
• 3. Results 15
• 3.1. Sequence analysis and mutagenesis of Gle1 and Dbp5 15
• 3.2. Purification of site-directed Gle1 mutant protein from D. hansenii 20
• 3.3. Purification of N-terminal truncated Dbp5 proteins from D. hansenii 23
• 3.4. Purification of site-directed Dbp5 mutant protein from D. hansenii 25
• 3.5. Purification of D. hansenii Gle1-Dbp5 complex protein 27
• 3.6. Molecular interactions of Gle1 and Dbp5 using SEC analysis 29
• 3.7. Three-dimensional structure predictions 42
• 4. Discussion 46
• 5. References 48