Proteomic analysis of rice - Cochliobolus miyabeanus interaction = 프로테오믹스 기법을 이용한 벼와 벼 깨씨무늬 병의 상호작용 연구

국문 초록 (Abstract)

최근 고품질 쌀 생산을 위해 비료를 사용하지 않고, 볏짚을 환원하지 않은 논의 사용, 지구온난화로 인한 기온 상승 등으로 벼 깨씨무늬 병의 발병 빈도와 면적이 점점 증가하고 있는 추세이며 현재, 벼와 벼 깨씨무늬 병에 대한 기작에 대한 연구는 국내외적으로 미흡한 실정으로 국내에는 벼 깨씨무늬 병에 대한 저항성을 가지고 있는 품종도 없어, 벼 깨씨무늬 병을 방제하기 위한 새로운 예방책을 마련하기 위해 벼와 벼깨씨무늬 병과의 상호작용에 대한 기작 규명이 요구된다. 따라서 최초로 벼와 벼 깨씨무늬 병에 대한 상호작용을 프로테오믹스적 기법을 사용하여 연구하였다.
4주 된 벼 잎에 깨씨무늬 병원균인 Cochliobolus miyabeanus를 5 x 105 conidia/mL의 농도로 포자를 분사 접종 하여 시간 별로 0, 12, 36, 48, 60 시간째에 잎을 각각 절취하여 활성산소종의 축적 또한 DAB staining으로 확인하였다. 36시간부터 잎 표면에 병반이 생기는 것에 반해 12 시간부터 H2O¬2 축적이 진행 됨을 확인하였다. 황산화 효소 관련 단백질들의 발현 정도를 알아보기 위해 수행한 Western blotting 결과, APx1과 APxb는 감염 된 지 12 시간부터 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 Cu/Zn SOD 또한 36 시간부터 발현함을 확인하였다. 이 결과들은 병원균에 침입에 의해 생성되는 ROS와 발현이 증가하는 황산화 효소가 기존의 다른 식물-병원균 상호작용에 대한 연구에서 나타나는 결과들과 일치하고 있음을 나타내고 있다.
벼 깨씨무늬 병을 처리한 벼의 잎에서 감염 시간에 따라 변화하는 spot의 발현 수준을 비교하여 어떤 단백질에 변화가 생겼는지를 발견하기 위하여 먼저, 이차원 전기영동(2-DGE)을 이용하여 분석하였다. 먼저 병 처리를 한 잎을 감염시간에 따라 회수하여 PEG 추출법을 이용해 각각 상등액, 침전물로 단백질을 추출하였다. 2-DGE분석을 수행한 결과, 총 63개의 spot이 감염 시간에 따라 발현 차이를 보였다. 감염 상태가 진행 될수록 증가하는 spot은 상등액에서 34개, 침전물에서 5개 총 39 개였으며 감소하는 spot은 상등액에서 19개, 침전물에서 5개로 총 24개의 spot을 확인할 수 있었다.2-DGE를 통해 분석 후 control과 비교하여 벼 깨씨무늬 병에 감염 진행 시간에 따라 단백질들이 발현이 어떻게 변화하는지를 명확하게 알기 위하여 각 spot의 volume 값을 이용하여 hierarchical clustering을 수행하였다. 총 63개의 단백질들은 fold change의 증감에 따라 증가하는 그룹(39개의 단백질) 감소하는 그룹(24개의 단백질)으로 나누어 졌다. 이 두 그룹 내 각 spot 들은 MALDI TOF/TOF MS기법을 이용하여 동정되었다. 또한 동정된 단백질들을 Gene ontology 분석을 수행하여 단백질들을 기능별로 분류하였다.
Biological category로 gene ontology를 수행한 결과 증가, 감소 두 그룹 모두 Metabolic pathway, 산화•환원에 관련된 단백질이 많이 동정 되었던 것을 확인할 수 있었으며, 감소되는 단백질 그룹의 경우 해당 과정에 관여되어 있는 것을 알 수 있었다. Cellular component 측면에서는 증가되는 단백질들이 extracellular region에 깊이 연관되어있는 것으로 보아 effector라 불리 우는 분비단백질들의 존재 가능성 및 발병 과정에서의 관련성이 추측 되어 진다.
벼 깨씨무늬병 곰팡이에 감염된 벼에서 동정된 단백질에서 많은 부분이 대사체와 관련이 있는 Glycolysis와 Calvin cycle에 관여한다는 것을 확인하였다. 따라서 이들 관련 단백질들의 발현 양상을 Metabolic pathway로 본 연구에서 도식화 하였다. Calvin cycle 관련 단백질들은 전체적으로 감염 시간이 진행됨에 따라 감소하는 패턴을 보이고 있다. 이것은 발병 과정에서 병원균이 벼 잎의 감염부에서 일어나는 광합성을 점차적으로 감소하도록 유도시키는 것으로 추측된다. Glycolysis에서 관련 단백질들의 전반적인 감소는 곰팡이에게 필요한 에너지 공급원을 막아 곰팡이의 분해를 이끄는 것으로 추측된다. 한 편, TCA cycle에서 Yang cycle (에틸렌 생합성 경로)로 가는 과정에서 전반적인 단백질 증가는 곰팡이 감염에 의한 초기 반응으로서의 에틸렌을 생산하는 것으로 생각된다.
이들 외에 동정 된 단백질 중 주요 기능을 할 것이라 예상되는 단백질, 특히 황산화 효소 관련 단백질, Chaperon system 그리고 extracellular region 관련 단백질들을 전체적인 깨씨무늬 병에 대한 벼 잎의 반응 메커니즘으로 간단하게 연결 시켜 도식화를 해보았다.
또한, 벼 깨씨무늬 병과 벼와의 상호작용에서 분비되는 단백들을 동정하기 위해 phenol 추출법을 이용하여 분비 단백질을 대량 추출하여 shotgun proteomics를 수행하여 생물정보학적 분석을 수행한 결과 벼에서 분비되는 단백질들은 탄수화물 대사와 단백질 분해 요소에 많이 관련이 되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 흥미롭게도 곰팡이에서도 단백질들이 동정된 것을 확인할 수 있었고 이들은 effector로서의 기능이 예상된다.
지금까지의 연구결과를 통해서 벼 깨씨무늬 병에 의해서 증가 또는 감소되는 단백질들이 기존의 식물-미생물 상호작용에서 일어나는 일반적인 병원균에 대한 식물체의 방어 기작과 아주 유사한 결과뿐만 아니라 벼 깨씨무늬 병에 대해서 특이적으로 유도되는 단백질들을 확보할 수 있었다. 따라서 이 유전자를 이용한 벼 깨씨무늬 병 방제 시스템 모델을 개발할 수 있을 것으로 기대한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The rice brown leaf spot disease caused by Cochliobolus miyabeanus, a necrotophic fungal pathogen is one of the causal agents resulting to the critical yield losses in rice cultivated in the worldwide. In this study, total proteins and secreted proteins during rice-C. miyabeanus interaction were for the first time analyzed using 2-dimensional electrophoresis (2-DE) and SDS-PAGE shotgun proteomics, respectively. Initially, Western blot revealed that accumulation of H2O2 and reactive oxygen species (ROS)-related proteins as markers for disease response was highly detected in leaves inoculated in the time course as judged for validation of experiment design. In 2-DE analysis, sixty three were differentially expressed in leaves infected with C. miyabeanus and identified by MALDI-TOF/TOF MS. Thirty nine proteins including novel PR proteins, oxidation-related proteins for disease response was highly detected in leaves inoculated by the time course as judged for validation of experiment. Interestingly, most of up-regulated proteins are involved in extracellular region that resulted from GO analysis based in cellular component term. Of the twenty four down-regulated proteins, calvin cycle and glycolysis pathway were significantly down-regulated during C. miyabeanus infection. In SDS-PAGE shotgun proteomics, 470 and 31 proteins were identified from rice and C. miyabeanus, respectively, during C. miyabeanus infection using nESI/MS/MS. Among them, 174 and 7 proteins from rice and C. miyabeanus, respectively, were identified as secreted proteins as retaining signal peptide. Among them, rice secreted proteins were related to stress response and ROS, whereas C. miyabeanus secreted proteins were involved in protein and cell wall hydrolysis. Taken together, these results show a possibility that secreted proteins might play key roles for the understanding the defense and attacking mechanism during rice and C. miyabeanus interaction and provide the first overview of the basic defense mechanism in rice against C. miyabeanus.

목차 (Table of Contents)

• 1. Abstract 1
• 2. Introduction 3
• 3. Materials and Methods 7
• 4. Results and Discussion 15
• 4-1. Morphological and physiological changes following C. miyabeanus infection 15
• 4-2. Identification of proteins in response to C. miyabeanus-rice interaction by 2-DE and MS 17
• 4-3. Confirmation of expression patterns of identified proteins in response to C. miyabeanus inoculation 17
• 4-4. Functional classification and subcellular localization of the identified proteins 26
• 4-5. Proteins related with Calvin cycle 30
• 4-6. Proteins related with glycolysis 33
• 4-7. Proteins related with methionine biosynthesis 33
• 4-8. 14-3-3 proteins involved in plant defense against pathogen 34
• 4-9. Antioxidant proteins from rice leaves during infection 34
• 4-10. Identification of In-vivo secretory proteins using SDS-PAGE shotgun proteomics 35
• 4-11. Functional categories of in vivo secreted rice proteins 35
• 4-12. Secreted rice proteins related with GH family 38
• 4-13. Secreted rice proteins related with Proteolysis 38
• 4-14. PR-proteins 39
• 4-15. Identification of putative effector proteins 40
• 5. Conclusions 44
• 6. References 46