Novel microwave plasma treated solutions (MPTS) trigger GSDME induced pyroptosis through intracellular ROS signaling in anaplastic thyroid cancer

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is one of the most aggressive cancers that is accompanied by a poor prognosis and resistance to multimodal treatments. Various drugs have a short response time and are likely ineffective against anaplastic thyroid cancer. Therefore, new molecular therapies and novel targets are needed to treat anaplastic cancers. Recently, plasma medicine has been used not only in basic fields, but also in biomedical applications on skin, wound healing, and cancer treatment of the liver, colon, and head and neck. However, direct plasma has difficulty treating, sustaining, and permeating the various affected areas. In this study, we prepared microwave plasma treated solutions (MPTS) and investigated their effect on ATC cells. Treatment with MPTS reduced the cell viability of ATC cells, which exhibited cell swelling and bubble formation morphologically. Gasdermin E(GSDME) was cleaved by MPTS and induced pyroptosis in ATC cells. Inhibiting caspase activity and knock down of GSDME showed reduced caspase-3 dependent cleavage of GSDME, consequently increasing cell viability and decreasing lactate dehydrogenase release. Furthermore, MPTS enhanced the production of intracellular reactive oxygen species (ROS) and induced phosphorylation of IRE1α that is associated with endoplasmic reticulum (ER) stress. Therefore, GSDME-mediated MPTS induced pyroptosis downstream of the ROS/ER stress pathway and activated caspase-3. We then confirmed tumor shrinkage through in vivo and histological analysis, with a focus on the increasing GSDME-N terminal. In summary, these results demonstrate that MPTS induces pyroptosis via GSDME activation and ROS generation in vitro and in vivo in anaplastic thyroid cancer models, suggesting a novel mechanism and indicating a potential chemotherapeutic approach for the treatment of ATC.

국문 초록 (Abstract)

최근 발생률이 급증하고 있는 갑상선 암은 분화 갑상선암 (differentiated thyroid cancer), 미 분화 갑상선암 (undifferentiated or anaplastic thyroid cancer), prooly differentiated carcinoma, 갑상선 수질암(medullary thyroid cancer로 분류되며, 그중 anaplastic thyroid cancer는 예후가 좋지 않고 다중치료에 대한 내성을 동반하는 가장 위험한 암 중 하나입니다. 이러한 anaplastic thyroid cancer의 우선적인 치료는 TSH 억제요법, 전이나 재발 병소에 대한 수술적 치료, 방사선 치료 등과 같은 다양한 치료법을 사용해도 반응 시간이 짧고 ATC에 효과가 없을 가능성이 높습니다. 따라서 ATC를 치료하기 위해서는 새로운 molecular therapy와 새로운 타겟으로 하는 약물의 개발이 필요합니다. 최근 의료관련 분야에 플라즈마 의학이 적용되고 있다, 특히, 저온 상압 플라즈마는 인체조직에 열 손상을 입히지 않을 뿐만 아니라, 암 치료, 살균, 치아미백, 지혈, 상처치유 등에서 높은 효율성을 보이고 있다. 그러나 이러한 저온 상압 플라즈마는 다양한 영향을 받는 부위에 치료, 유지 및 침투하는 데 어려움이 있습니다. 본 연구에서는 기존 저온 상압 플라즈마를 개선한, Microwave plasma treated solutions (MPTS)을 만들고 ATC에 미치는 영향을 연구했습니다. MPTS를 이용한 치료는 형태학적으로 세포 팽창과 거품 형성을 나타내며 ATC 세포의 생존력을 감소시켰습니다.또한, MPTS를 처리시, 새로운 암세포의 사멸중 하나인, pyropotosis를 유도하며, Gasdermin E(GSDME)가 MPTS에 의해 절단되어, ATC에서 pyroptosis를 유도하였습니다. Caspase 활성 억제 및 GSDME의 knock down은 caspase-3 의존적 GSDME cleavage 감소를 보여 결과적으로 세포 생존력을 높이고 LDH방출을 감소시켰습니다. MPTS는 세포 내 활성 산소 종(ROS)의 생성을 강화하고 소포체(ER) 스트레스와 관련된 IRE1α의 인산화를 유도했습니다. 따라서 GSDME 매개 MPTS는 ROS/ER 스트레스 경로의 하류로 pyroptosis를 유도하고 활성 caspase-3를 유도했습니다. 요약하자면, 이러한 결과는 MPTS가 GSDME 활성화와 ROS 생성을 통해 pyroptosis를 유도하여 새로운 메커니즘을 제안하고 ATC 치료를 위한 잠재적 치료법을 나타낸다는 것을 보여줍니다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Material and Method 5
• A. Cell lines and reagents 5
• B. Microwaved plasma treated solution characteristics and treatment 6
• C. Cell viability assay 6
• D. LDH assay 7
• E. Western blot analysis 7
• F. Lived and Dead 8
• G. RNA interference analysis 9
• H. Annexin V and propidium iodide saining 9
• I. Intracellular ROS measurement 9
• J. Extracellular ROS and Nitric Oxide measurement 10
• K. Transmission electron microscopy (TEM) 11
• L. PI staining 11
• M. Statistical analysis 12
• Ⅲ. Results 13
• A. MPTS induces cell death in anaplastic thyroid cancer cells 13
• B. MPTS induces pyroptotic cell death in anaplastic thyroid cancer cells 15
• C. GSDME- dependent pyroptosis is regulated by caspase-3 activation 17
• D. Suppression of GSDME gene expression by siRNA attenuates MPTS-induced pyroptotic cell death 18
• E. MPTS triggers GSDME-dependent pyroptotic cell death through ER stress and MAPK/ROS signaling pathways 19
• Ⅳ. Discussion 41
• Ⅴ. Reference 44