Anti-cancer effect of melittin-derived peptide in organoid model of prostate cancer

국문 초록 (Abstract)

전립선암은 유럽과 미국에서 남성에게 가장 흔하게 진단되는 비피부 악성 종양이자 전 세계적으로 두 번째로 흔한 암 사망 원인입니다. 전립선에서만 자라는 암의 경우 성장 속도가 느리고 다른 암에 비해 5년 생존율이 훨씬 높습니다. 하지만 림프절이나 뼈로 전이되는 전이성 전립선암에서는 5년 생존율이 급격히 떨어집니다.

종양 미세환경은 질병의 경과와 치료반응에 영향을 미칩니다. 가장 공격적인 고형 종양은 높은 수준의 골수 세포 침윤, 즉 종양관련대식세포 (TAM)를 가지고 있습니다. 세포 외 기질과 함께 종양 미세환경의 서로 다른 세포 사이의 상호작용을 요약하는 것은 질병 진행의 기본 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이는 특히 표준 치료법들에 대한 치료 반응 예측과 종양 미세환경 표적 치료제의 효능에 대한 조사에 적용됩니다.

대식세포는 본질적인 종양 파괴 특성을 가지고 있지만 대부분의 종양관련대식세포는 종양 부위에서 M2 유사 대식세포의 기능적 특성을 주로 나타냅니다 (LIssbrant I. F.,2000). 최근에는 M2 유사 대식세포가 정상 전립선에서 전이성 거세저항성 전립선암 (mCRPC)로 단계적 증가하는 것으로 알려졌습니다. 종양관련대식세포의 밀도가 높을수록 경요도 전립선 절제술 후 종양 재발 위험이 높아집니다.
펩타이드 약물 접합체는 새롭게 고안된 치료 약물입니다. 표적에 약물을 전달하는 펩타이드와 세포독성제를 연결해 원하는 표적만 사멸시키도록 설계한 것입니다.

TB511은 M2 유사 대식세포를 표적으로 하는 것으로 알려진 멜리틴 변형 펩타이드를 세포독성물질로서 사용하고 미토콘드리아 막을 파괴하는 것으로 알려진 KLA(KLAKLAK)2와 연결하도록 설계됐습니다. 본 연구에서는 M2 대식세포에서 확인된 표적 단백질을 통해 TB511이 세포자멸사를 유도하고 항암 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 3D-3멀티셀룰라 스페로이드 방법을 이용하여 종양 미세환경을 구축했습니다. 스페로이드는matrigel matrix를 사용하여 3D 배양에서 성장한 PC3 또는 Docetaxel resistance PC3, CAF 및 THP-1로부터 형성되었습니다.

TB511을 이용한 전립선암 스페로이드 치료의 효능을 확인하기 위해 THP-1 세포사멸에 따른 스페로이드 크기의 변화와 종양 성장 인자인 Ki-67 및 EMT 관련 마커에 대한 면역형광염색을 시행하였습니다.

PC3 또는 docetaxel resistant PC3, CAF 및 THP-1 세포를 matrigel matrix를 사용하여 공동 배양하고 type 1 collagen의 발현을 통해 스페로이드의 형성을 확인하였습니다. 여기에 TB511을 처리한 경우 THP-1 세포는 농도 의존적으로 감소하였는데 이는 TB511이 M2 대식세포에서 확인된 표적 단백질을 통해 세포사멸을 유도한다는 것을 시사합니다. TB511에 의해 THP-1 세포의 수가 농도 의존적으로 감소함에 따라 스페로이드의 크기가 크게 감소했습니다. 스페로이드의 크기가 감소함에 따라 Ki-67과 vimentin의 발현 수준도 감소했습니다.
종합해보면, TB511은 3D-3 오가노이드에 의해 형성된 전립선암 종양 미세환경에서 M2 대식세포를 특이적으로 표적화하여 세포사멸을 유도하고 종양의 증식을 억제함으로써 항암효과를 나타내고 있습니다.

키워드 : 전립선암, 종양관련대식세포, 펩타이드 약물 접합체, TB511, 종양 미세환경, 스페로이드, 3D-3 오가노이드, 섬유아세포

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In both Europe and the United States, prostate cancer remains the most commonly diagnosed non-cutaneous malignancy in men and the second most common cause of cancer death worldwide. The growth of prostate cancer is slow, and in the case of cancer that grows only in the prostate, the 5-year survival rate is much higher than other cancers. However, in metastatic prostate cancer that spreads to lymph nodes or bones, the 5- year survival rate decreases rapidly. The tumor microenvironment (TME) shapes disease progression and influences therapeutic response. Most aggressive solid tumors have high levels of myeloid cell infiltration, namely tumor-associated macrophages (TAM). Recapitulation of the interaction between the different cellular players of the TME and the extracellular matrix (ECM) is critical for understanding the mechanisms underlying disease progression. This particularly holds true for predicting therapeutic response(s) to standard therapies and interrogating the efficacy of TME-targeting agents. Macrophages have intrinsic tumoricidal properties, yet most TAMs predominantly displayed functional characteristics of M2-like macrophages in tumor sites (Lissbrant et al.,2000). Recently, it has come to appreciate that the M2-TAMs increased stepwise from normal prostate to mCRPC. A higher density of TAMs increases the risk of tumor recurrence after transurethral resection of the prostate. Peptide drug conjugates are a newly designed therapeutic drug. It is designed to kill only the desired target by linking a peptide that delivers the drug to the target and a cytotoxic agent. TB511 was designed to link a melittin-modified peptide known to target M2-like macrophages with KLA(KLAKLAK)2, which is known to disrupt the mitochondrial membrane as a cytotoxic agent. In this study, to determine whether TB511 induces apoptosis and exhibits anticancer effects through target protein identified in M2 macrophages, a tumor microenvironment was established using the 3D-3 multicellular spheroid method. Spheroids were established from prostate cancer cells (PC3) or docetaxel-resistant prostate cancer cells (docetaxel-resistant PC3), Cancer-associated Fibroblasts (CAF), and Tumor-associated Macrophages (TAM), grown in 3D culture using a Matrigel matrix. To confirm the efficacy of treating prostate cancer spheroids with TB511, changes in spheroid size due to THP-1 apoptosis and immunofluorescence staining were performed for Ki-67, a tumor growth factor, and EMT-related markers. PC3 or docetaxel-resistant PC3, CAF, and THP-1 cells were co-cultured using the Matrigel matrix, and the formation of the spheroids was confirmed through the expression of type Ⅰ collagen. When the tumor spheroids were treated with TB511, THP-1 cells decreased concentration- dependent, suggesting that TB511 induces apoptosis through a target protein identified in M2 macrophages. The size of the spheroids significantly decreased as the number of THP-1 cells decreased in a concentration-dependent manner by TB511. As the size of the prostate cancer tumor spheroids decreased, the expression level of Ki-67 and vimentin also decreased. TB511 exhibits anti-cancer effects by specifically targeting M2 macrophages in the prostate cancer tumor microenvironment formed by 3D-3 organoids, causing apoptosis and suppressing tumor proliferation. Keywords: prostate cancer, TAM (tumor associated macrophages), peptide-drug conjugates, TB511, TME (tumor microenvironment), spheroid, 3D-3 organoid, CAF (cancer-associated fibroblast)

목차 (Table of Contents)

• Abstract - i
• Contents - iv
• List of Figures v
• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and methods 6
• Ⅲ. Results 9
• Ⅳ. Discussion 32
• V. References 37