Exploring the role of glycolipid transfer protein domain-containing 2 (GLTPD2) in sphingomyelin-cholesterol homeostasis in small intestinal epithelial cells = 소장 상피세포에서 스핑고마이엘린-콜레스테롤 항상성에 관여하는 glycolipid transfer protein domain-containing 2 (GLTPD2)의 역할 탐구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Membrane lipid homeostasis is essential for maintaining cellular integrity and relies on coordinated vesicular and non-vesicular lipid transport mechanisms. Sphingomyelin is a major plasma membrane (PM) lipid that contributes to ordered membrane domains and is primarily synthesized at the trans-Golgi network (TGN). However, protein-mediated regulation of sphingomyelin trafficking along the TGN–PM axis remains poorly understood, particularly in the small intestine, where epithelial cells exhibit exceptionally high sphingolipid demand and continuous membrane stress.
Here, glycolipid transfer protein domain-containing 2 (GLTPD2), the only member of the glycolipid transfer protein (GLTP) superfamily whose structure and function remain poorly characterized, is investigated in the context of small intestinal lipid homeostasis. Structural modeling revealed a unique N-terminal α-helix in GLTPD2, predicting isoform-specific subcellular targeting. Experimental analyses provided evidence that GLTPD2 isoform 2 preferentially associates with the TGN membrane, whereas isoform 1 displays characteristics consistent with a secretory protein. Transcriptomic analyses further showed that human GLTPD2 expression is enriched in the small intestine and predominantly localized to enterocytes, suggesting a link to intestinal lipid regulation. Sequence homology and structural analyses implicated sphingomyelin as a potential ligand for GLTPD2. Consistently, CRISPR–Cas9-mediated depletion of GLTPD2 in Caco-2 cells resulted in marked alterations in membrane lipid composition, including reduced sphingomyelin and free cholesterol levels, increased glycosphingolipids, and accumulation of lysophospholipids and ether phospholipids, indicative of membrane stress and compensatory remodeling. These lipid perturbations were accompanied by impaired fatty acid absorption and increased susceptibility to specific enteric pathogens.
Together, these findings suggest a role for GLTPD2 in sphingomyelin-associated lipid homeostasis in enterocytes and provide a basis for further investigation into its physiological significance.

국문 초록 (Abstract)

세포막 지질 항상성은 세포의 구조적 무결성을 유지하는 데 필수적이며, 소포성 및 비소포성 지질 수송 기전의 정교한 조절에 의해 유지된다. 스핑고마이엘린은 정렬된 막 도메인의 형성에 기여하는 주요 세포막(plasma membrane, PM) 지질로, 주로 trans-Golgi network (TGN)에서 합성된다. 그러나 TGN–세포막 축을 따라 이루어지는 스핑고마이엘린 이동 과정에서 단백질 매개 조절 기전에 대해서는 아직 충분히 이해되지 않았으며, 특히 지속적인 막 스트레스에 노출되는 소장 상피에서 이러한 조절 메커니즘은 더욱 불분명하다.
본 연구에서는 glycolipid transfer protein (GLTP) 계열 단백질 중 구조적·기능적 특성이 아직 충분히 규명되지 않은 유일한 구성원인 glycolipid transfer protein domain-containing 2 (GLTPD2)를 소장 지질 항상성의 맥락에서 분석하였다. 구조 예측 분석을 통해 GLTPD2 는 N-말단 α-나선을 가지는 독특한 구조적 특징을 지니는 것으로 확인되었으며, 이를 바탕으로 아이소폼 특이적인 세포 내 위치 조절 가능성이 예측되었다. 실험적 분석 결과, GLTPD2 아이소폼 2 는 스핑고마이엘린 합성이 이루어지는 TGN 막과 주로 연관되는 반면, 아이소폼 1 은 분비형 단백질의 특성을 보였다. 전사체 분석을 통해 인간 GLTPD2 는 대장에 비해 소장에서 높은 발현을 보였으며, 특히 소장 상피 흡수세포에 주로 국한되어 발현됨이 확인되어 장 지질 조절과의 연관성을 시사하였다. 서열 상동성 및 구조 분석 결과, 스핑고마이엘린이 GLTPD2 의 잠재적 리간드 후보로 제시되었다. 이에 따라 CRISPR–Cas9 시스템을 이용해 GLTPD2 를 결손시킨 Caco-2 세포에서 지질 조성을 분석한 결과, 스핑고마이엘린과 자유 콜레스테롤의 감소와 함께 당스핑고지질의 증가가 관찰되었으며, 라이소인지질 및 에테르 인지질의 축적을 통해 막 스트레스 및 보상적 막 재구성 반응이 시사되었다. 이러한 지질 변화는 지방산 흡수 능력의 저하와 특정 장내 병원균에 대한 감염 방어 능력 감소와 동반되었다.
종합적으로 본 연구는 GLTPD2 가 소장 상피 흡수세포에서 스핑고마이엘린 관련 지질 항상성과 연관됨을 시사하며, GLTPD2 의기능적 중요성과 향후 연구의 기반을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. Study Background 1
• 1.2. Purpose of Research 5
• Chapter 2. Materials and Methods 7
• 2.1. Cell culture and differentiation of Caco-2 cells 7
• 2.2. Computational prediction and structural visualization of GLTP superfamily proteins 8
• 2.3. Overexpression and immunoblot analysis of GLTPD2 isoforms in HEK293T cells 11
• 2.4. Tissue-specific and single-cell expression profiling of GLTP superfamily genes 14
• 2.5. Genome-wide association analysis of GLTPD2 17
• 2.6. Generation of GLTPD2-KO Caco-2 cells 18
• 2.7. Lipidomic analysis of Caco-2 WT and GLTPD2-KO cells 20
• 2.8. RNA sequencing and Gene Ontology analysis of Caco-2 WT and GLTPD2-KO cells 22
• 2.9. Intracellular cholesterol quantification 23
• 2.10. Flow cytometric quantification of membrane cholesterol 24
• 2.11. Cell morphology, growth, and barrier integrity analysis 25
• 2.12. BODIPY FL C16 lipid uptake assay 26
• 2.13. Bacterial infection (EPEC and Salmonella Typhimurium) 28
• Chapter 3. Results 30
• 3.1. Unique structure and subcellular localization of human GLTPD2 within the GLTP superfamily 30
• 3.2. GLTPD2 is predominantly expressed in the small intestineand other membrane-dynamic tissues 38
• 3.3. Predicted structural resemblance and sphingolipid-binding pocket similarity between GLTPD2 and CPTP 41
• 3.4. GLTPD2-KO cells show altered sphingolipid composition with a marked reduction in sphingomyelin 44
• 3.5. Membrane lipid remodeling signatures associated with sphingomyelin depletion in GLTPD2-KO cells 52
• 3.6. Transcriptomic evidence of lipid metabolic disruption and membrane-associated dysfunction in GLTPD2-KO cells 58
• 3.7. Functional impairment of intestinal epithelial integrity in GLTPD2-KO cells 61
• 3.8. Predicted membrane interaction of GLTPD2 67
• 3.9. GWAS and disease associations of GLTPD2 70
• Chapter 4. Conclusion & Discussion 74
• 4.1. Conclusion 74
• 4.2. Discussion 78
• Bibliography 91
• Abstract in Korean 105