농축 혈소판(PRP)의 사이토카인 분포와 피부 세포의 증식 및 이동에 미치는 matrix metalloproteinase(MMPs)의 조절 연구 = Characterization of the cytokine profile of platelet rich plasma (PRP) and PRP-induced cell proliferation and migration: Upregulation of matrix metalloproteinase-1 and -9 in HaCaT cells

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background

The underlying rationale of platelet rich plasma (PRP) therapy is that an injection of concentrated PRP at the site of injury may promote tissue repair via cytokine release from platelets. The molecular mechanisms of PRP therapy in the skin wound healing process are not well understood at present, and would benefit from clarification.

Methods

PRP was stimulated with angonists for 5 min, and cytokine profile analysis was performed.
To investigate the wound healing activity of PRP, cell proliferation and migration analyses were performed in skin cells. The effects of PRP were analyzed on the expression and activity of matrix metalloproteinase (MMP)-1, -2, -9, and the activation of transcription factors.

Results

Thrombin was found to be a strong stimulator of PRP activation to release growth factors and chemokines. PRP induced cell proliferation and migration in HUVECs, HaCaT cells, and HDFs, as well as MMP-1and MMP-9 expression in HaCaT cells, but PRP did not have a significant effect on the expression or activity of MMPs in HDFs. The transcription factors, including signal transducer and activator of transcription- 3 (STAT-3) were found to
be phosphorylated following PRP treatment in HaCaT cells.

Conclusion

In this study, we have identified the cytokine profile of activated PRP after agonist stimulation. We have shown that PRP plays an active role in promoting the proliferation and migration of skin cells via the regulation of MMPs, and this may be applicable to the future development of PRP therapeutics to enhance skin wound healing.


Key Words : Platelet rich plasma (PRP), Wound healing, Cytokine profile, Cell proliferation, Cell migration, Matrix metalloproteinase

국문 초록 (Abstract)

연구배경:
농축 혈소판(Platelet Rich Plasma, PRP)의 사이토카인 및 성장인자, 키모카인들에 의한 염증반응, 조직재생 및 상처치유의 기능은 현재 많은 주목을 받고 있다. 특히 상처치유의 과정에는 세포의 증식, 이동 및 세포외 기질의 합성과 분해에 의한 세포외 기질 재구성과 피부세포의 표피 재생성 등이 주요하게 작용하고 있다. 따라서 본 연구에서는 1) 각 길항제에 의한 농축 혈소판의 활성화에 따른 사이토카인과 성장인자들의 분비를 연구하고 2) 농축 혈소판에 의한 피부세포들의 이동, 증식 영향 및 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현 조절 연구 3) 농축 혈소판에 의한 MMP 발현 조절의 세포내 신호전달 체계에 대해 살펴보았다.

연구방법:
농축 혈소판(PRP)의 분리는 ACD tube에 혈액을 채취한 후 250 Xg, 15 min, 37℃ 에서 원심분리 하고 플라즈마 층만을 모아서 37℃에 10 분간 배양 후 1900 Xg, 8 min 37℃ 에서 원심 분리한다. 침전부분을 Washing buffer (Tyrode’s albumin solution) + 10 U/ml heparin + 0.5 uM PGI2를 넣은 후 침전을 풀어준 후 10 분간 37℃에서 배양 시키고 1900 Xg, 8 분간 37℃ 에서 원심분리 하여 혈소판을 모으고 혈소판 개수를 세어 실험에 사용한다. 농축 혈소판의 활성화 연구는 vwf, Ca2+ (%), Thrombin, collagen, ADP로 5분간 처리한 후 멀티플렉스 분석을 이용해 혈소판 내 사이토카인과 성장인자의 분포를 분석하였다. 농축 혈소판에 의한 세포이동 및 증식기전규명 연구를 위해 피부세포의 일종인 HaCaT 세포와 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast(HDF))를 10% DMEM에서 배양하여 이용하였다. PRP 처리에 의한 MMP의 발현조절 및 세포내 신호전달 체계는 10% 농축혈소판을 피부세포에 처리하고 웨스턴 블로팅 분석과 자이모그래피를 수행하여 확인하였다.

연구결과:
각 길항제에 의한 농축 혈소판의 활성화 효과는 트롬빈에서 PDGF와 TGF-β를 비롯한 성장인자와 사이토카인의 발출 비율이 높음을 알 수 있었다. 피부세포의 증식과 이동에 미치는 농축 혈소판 효과는 피부세포에서 유사한 비율로 세포의 증식과 이동을 증가시킴을 확인하였다. 또한 농축 혈소판 처리 시 피부세포에서 MMP-1의 발현이 증가함을 웨스턴 블로팅 분석을 통해 확인하였다. MMP-2, 9의 발현조절 연구는 자이모그래피를 수행하여 측정하였으며 역시 피부세포에서 MMP-9의 활성을 증가함을 알 수 있었다. 농축 혈소판에 의한 MMPs 발현과 활성에 관련 세포내 신호전달 체계에 대한 연구로 NF-kB, JNK, STAT-3의 활성이 주요하게 관련되어 있음을 확인하였다.
결론:
본 연구를 통해 농축 혈소판이 피부재생 및 상처치유에 주요하게 관여함을 확인하였고 메커니즘 연구로 피부세포에서 MMP-1, 9의 발현을 증가시킴으로 세포의 이동과 증식, 세포내 기질의 재구성에 관여함을 알 수 있었다.

목차 (Table of Contents)

• I.서론 1
• II. 재료 및 방법 4
• III. 결과 11
• IV. 고찰 23
• V. 결론 24