Bioconversion and characterization of aesculetin and resveratrol glucosides using glycosyltransferase = 당 전이 효소를 이용한 에스큘레틴과 레즈베라트롤의 배당체 합성 및 특성 분석

국문 초록 (Abstract)

식물체에서 생산되는 폴리페놀인 에스큘레틴과 레즈베라트롤은 식물체가 합성하는 이차 대사산물이다. 폴리페놀은 식물체에서 식물 조직을 보호하고 지지하는 역할을 하며 화분 매개자인 곤충, 동물을 유인할 뿐만 아니라 다른 식물의 생장과 발달을 저해하기도 한다. 더구나 폴리페놀은 식물과 주위 환경과의 상호 작용에서 신호전달 물질이며 식물이 죽은 뒤에도 몇 주 또는 몇 달간 분해되지 않고 유지되면서 토양에 존재하는 분해자와 분해 과정에 영향을 끼쳐 생태계에서도 중요한 역할을 가진다. 최근 들어 이러한 폴리페놀의 건강식품과 약품으로서 연구가치가 증대되고 있으며, 이미 체내에 유익한 항염증, 항산화와 항암 등의 잠재성이 확인되고 있다. 그러나 폴리페놀의 체내에 적용은 낮은 수용성 때문에 양보다 오히려 배설되는 양이 많고 세포독성을 가질 수 있다는 문제점이 한계로 지적된다. 이런 문제점은 폴리페놀의 당화과정 (glycosylation) 을 통하여 합성된 배당체를 이용하여 극복할 수 있다. 배당체의 합성은 화학적 방법으로 가능하지만, 이런 방법은 고온, 고압을 포함하는 조건이 필수적이고 합성된 아노머 (anomer) 물질의 분리 및 환경문제 등을 일으켜 최근에는 생물체가 지니는 당 전이 능력을 갖추는 효소를 이용한 당 전이 반응 (transglycosylation) 을 통하여 빠르고 쉽게 생산하고 있다. 더욱이 효소적 방법은 위치특이적, 입체특이적인 배당체 생산을 만들고 동시에 합성 반응이 일원화된다는 장점이 있다.
당 전이 효소로는 기존에 당 분해 활성이 있는 glycosidase를 이용하는 방법과 glycosyltransferase를 이용하는 방법이 있는데, glycosidase를 이용한 당 전이 반응은 공여체로 넓은 기질 특이성과 다양한 결합 구조를 갖는 전이산물을 합성할 수 있는 장점이 있지만 합성된 배당체가 효소에 의하여 다시 가수분해될 수 있어 전이산물의 수율이 낮다는 문제점이 있다. Glycosyltransferase의 경우 전이 산물의 수율이 높지만 대부분 알려진 전이효소는 공여체로 산업화하기에는 비싼 기질인 뉴클레오티드가 결합된 복합기질을 이용한다는 점이 단점이다.
당 전이 효소 중에서도 뉴클레오티드가 결합된 복합기질이 아닌 sucrose나 malto-oligosaccharide를 기질로 이용하는 효소인 amylosucrase (ASase) 나 maltosyltransferase (MTase) 를 통해 알파 1,4 글루코사이드 결합을 통하여 다당류인 아밀로오스를 생산한다. ASase는 수용체로서 글루칸 뿐만 아니라 카테킨, 살리신, 그리고 알부틴을 수용체로 활용하여 포도당을 전이하는 능력이 있음이 확인되었다. 또한, MTase는 daidzein과 같은 폴리페놀을 전이하여 높은 수용성을 가지는 maltosyl daidzein을 합성함을 확인하였다.
본 연구에서는 고온성 미생물인 Caldicellurosiruptor bescii 균주로부터 유래한 MTase와 심해 미생물인 Alteromonas macleodii Deep ecotype에서 유래한 ASase 효소의 기본 특성을 확인하고 이를 산업적으로 응용하기 위하여 난용성 천연물인 에스큘레틴과 레즈베라트롤을 이용하여 배당체를 합성하였다. 당 전이 효소에 의해 합성된 에스큘레틴과 레즈베라트롤의 배당체는 본래의 비당체보다 수용성이 당쇄 결합을 통해 크게 향상되는 것을 확인하였다. 특히 MTase에 의해 합성된 maltosyl piceid는 본래의 레즈베라트롤보다 수용성이 8.54 103 배 향상되어 식품첨가제 및 건강식품제재로서 이용가치가 기대된다. ASase에 의해 합성된 α-cichoriin과 α-piceid isomers의 항증식 효과 및 미백 효과가 각각 확인되었으며 glycosynthase인 β-glucosidase N291T에 의해 합성된 glucosyl aesculin의 경우 aesculin보다 항염증 효과가 향상하였음을 대식세포인 RAW264.7 cells를 통해 in vitro상에서 확인하여 항염증제제로서 이용될 수 있을 것이다. 이런 연구 결과를 토대로 당 전이 효소가 식품, 화장품, 및 제약산업에서 높은 잠재성을 갖는 폴리페놀 배당체의 효소적 합성에 매우 효율적인 촉매로 활용될 수 있다는 것을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 5
• 1. Materials 5
• 1.1. Chemicals and reagents 5
• 1.2. Animal cell culture 5
• 2. Methods 7
• 2.1. Maltosyltransferase (MTase) from Caldicellurosiruptor bescii 7
• 2.1.1. Expression and purification of recombinant MTase 7
• 2.1.2. MTase transglycosylation assay 8
• 2.1.3. Enzymatic synthesis of maltosyl piceid 9
• 2.1.4. α-glucosidase hydrolysis 9
• 2.2. Amylosucrase (DGAS) from Deinococcus geothermalis 10
• 2.2.1. Preparation of recombinant DGAS 10
• 2.2.2. Biosynthesis of polyphenolic glycosides 11
• 2.3. Amylosucrase (AMAS) from Alteromonas macleodii Deep ecotype 11
• 2.3.1. Preparation of recombinant AMAS 11
• 2.3.2. AMAS transglycosylation assay 12
• 2.3.3. Enzymatic synthesis of glucosyl piceid 13
• 2.4. β-glucosidase N291T from Thermotoga neapolitana 14
• 2.4.1. Preparation of β-glucosidase N291T 14
• 2.4.2. Biosynthesis of glucosyl aesculin 14
• 2.5. Biotransformation using E. coli cell culture 15
• 2.6. Purification of the newly synthesized compounds 15
• 2.7. TLC and HPLC analysis 16
• 2.8. Nuclear magnetic resonance analysis 17
• 2.9. Analysis of in vitro correlation data for the transfer products 18
• 2.9.1. Solubility determination 18
• 2.9.2. Tyrosinase inhibition assay 18
• 2.9.3. Drug treatment on animal cells 19
• 2.9.4. Cell viability assay: MTT assay 19
• 2.9.5. Luciferase assay 20
• 2.9.6. Western blot analysis 20
• 2.9.7. RNA extraction and RT-PCR 21
• 2.10. Statistical analysis 22
• III. Results and Discussion 23
• 1. Enzymatic synthesis of piceid glucosides using MTase from Caldicellurosiruptor bescii DSM 6725 23
• 1.1. Purification of recombinant MTase 23
• 1.2. Enzyme properties of MTase 23
• 1.3. Transglycosylation of piceid by MTase 27
• 1.4. Separation of piceid glucosides and structural analysis of the major piceid glucosides 29
• 1.5. Water solubility of maltosyl piceid 34
• 2. Bioconversion of piceid to piceid glucoside using AMAS from Alteromonas macleodii Deep ecotype 36
• 2.1. Purification of recombinant AMAS 36
• 2.2. Characterization of AMAS 36
• 2.3. Glucosylation of piceid by AMAS 40
• 2.4. Structural analysis of glucosyl piceid 43
• 2.5. Water solubility of piceid and piceid glucoside 44
• 3. Glycosylation confers anti-inflammatory activity to aesculin 49
• 3.1. Enzymatic synthesis of glucosyl aesculin 49
• 3.2. Luciferase assay and western blot of RAW264.7 cells treated by glucosylaesculin 51
• 3.3. Effects of glucosyl aesculin on gene expression of NQO1, GCLC and HO-1 in RAW264.7 cells 53
• 4. Change of the biological activity by transglycosylation reaction using DGAS 55
• 4.1. Effects of α-piceid isomers on activity of tyrosinase 55
• 4.2. Antiproliferative effect of α-cichoriin on the various animal cells 56
• IV. Conclusion 61
• V. Reference 62
• VI. Abstract 73