Growth factor가 첨가된 현탁식 배양 가능 무혈청 배지 개발에 관한 연구 = (A) study on developing a serum-free medium for suspension aulture supplemented with growth factors

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 B형 간염 바이러스 치료제인 인간화된 항체를 대량으로 생산할 수 있는 보다 효율적인 scale-up의 방법을 제시하기 위해 짧은 adaptation 기간을 요구하는 suspension 가능 serum-free medium의 개발에 관하여 연구해 보았다.
본 연구에 사용된 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포는 배양 용기 표면에 붙어 자라는 세포로 이전까지는 배양 용기의 접촉 표면적을 늘려 생산물을 대량 생산하는 방법이 주로 연구되어 왔다. 그러나 이런 방법은 배양 용기 표면적의 제한과 여러 조작상의 어려움으로 인해 최근에는 보다 효율적인 scale-up의 방법으로 현탁식 배양으로의 적응연구가 활발히 수행되고 있다. 이와 동시에 동물세포배양에 이용되는 혈청 포함 배지는 높은 비용, 분리정제의 어려움, 바이러스에 의한 오염의 위험성 그리고 실험의 재현성이 어렵다는 단점이 있어 무혈청 배지의 개발이 진행되고 있다. 기존의 무혈청 배지를 이용한 현탁식 배양으로의 적응연구를 보면, 대개 수개월 내지 2-3년 정도의 많은 시간과 노력이 투자되었다. 그래서 본 연구에서는 이런 문제를 해결 할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.
본 연구는 크게 두 단계로 나누어서 진행되었는데 1 단계는 현탁식 배양 가능 배지 개발과 관련된 연구로 칼슘과 EDTA의 농도 그리고 배양 용기의 바닥 표면 성질 조절에 따른 세포의 성장 및 그 거동을 보고 현탁식 배양에 적합한 기초 배양 배지의 조성과 배양 용기 바닥의 표면 성질을 결정하는 것이고 2 단계는 무혈청 배양 배지 개발과 관련된 연구로 1단계 연구를 통해 얻어진 결과로 만들어진 기초 배지에 여러 종류의 growth factor와 혈청 대체 물질들을 첨가하여 세포의 성장과 그 거동을 보고 가장 좋은 결과를 보인 조건을 찾아서 본 실험에 사용된 세포에 적합한 하나의 완성된 현탁식 배양 가능 무혈청 배지를 개발하는 것이다.
현재 칼슘은 세포 외 신호를 세포 내로 전달하는 2차 전달자로서 뿐만아니라 신진 대사의 조절 인자로서 그리고 세포 상호간의 aggregation과 세포와 substrate와의 attachment에 영향을 주는 물질로 인식되고 있다. 따라서 현탁식인 경우 세포 상호간의 aggregation과 세포와 substrate와의 attachment를 최소화하고 성장에 나쁜 영향을 주지 않는 칼슘의 농도를 찾아야 하며 사용되는 배양 용기도 바닥 표면 상태와 조건에 따라 세포의 성장 거동을 다르게 하므로 목적에 맞추어 잘 선택하여야 한다. 이전 연구에서는 주로 agitation의 영향에 대해서만 조사하였는데 본 연구에서는 CHO 세포의 최적 칼슘과 EDTA 농도 그리고 배양 용기의 바닥 표면 상태에 따른 세포 성장 거동 차이를 알아보고 현탁식 배양을 위한 가장 최적의 농도와 배양 용기 표면의 환경을 찾기 위해 여러 칼슘의 농도에서 세포의 성장을 보고 또한 용기의 표면 차이에 따른 세포의 성장 거동을 살펴보았다.
그리고 혈청은 생리 활성조절인자 이외에도 많은 종류의 복잡하고 다양한 물질들을 대량 포함하고 있다. 이들 물질은 세포의 증식뿐만 아니라 분화기능을 억제하는 작용을 하고 있으며, 한편으로는 세포가 생산하는 목적 생산물을 분리하고 정제하는 일을 어렵게 만든다. 또한 혈청은 세포 배양의 재현성을 저하시키고 오염의 발생원으로 작용을 한다. 그리하여 많은 연구자들은 혈청 성분을 검토하여 배지 성분에서 혈청을 제거하고자 노력하였다. 일반적으로 무혈청 기본 합성 배지만으로는 세포가 충분한 증식 특성을 나타내지 못하므로 반드시 기본 합성 배지 중에 세포의 증식과 기능발현에 필요한 다양한 영양분과 다른 여러 성장인자들이 첨가 또는 강화되어야 한다. 그래서 무혈청 배양에 대한 실험에서는 이들 중 대상 세포가 요구하는 성장인자가 무엇인지를 탐색하고, 요구하는 양을 첨가하는 것이 일반적이다.
따라서 본 연구에서는 우선 현탁식 배양에 적합한 basal medium의 조성과 배양 용기의 환경을 조사하고 여기에 여러 growth factor들과 여러 종류의 혈청 대체물 그리고 여러 영양성분들을 첨가하여 성장 및 성장 거동을 관찰하여 그 결과로 현탁식 배양 가능 무혈청 배양 배지 개발에 필요한 조건을 찾고자 노력하였다.