Overexpression of CITED4 inhibits cancer progression in TNBC = 삼중음성유방암에서의 CITED4 과발현에 의한 암 발생 억제 연구

국문 초록 (Abstract)

세계 여성 암 1위이며 한국 여성 암 중에서 2위를 차지하고 있는 유방암은 병리학적으로나 임상학적으로 매우 복잡한 양상을 띠고 있는 암으로 알려져 있다. 그 중 삼중음성유방암은 유방암의 하위 분류군 중에서 전체 유방암 환자의 약 15~20%를 차지하며, 예후가 가장 좋지 않고 비교적 젊은 연령층에서 발병할 확률이 높다고 알려져 있다. 여느 유방암 하위 분류군과는 달리, 삼중음성유방암은 세포막에 에스트로겐 수용체, HER2 수용체, 프로게스테론 수용체를 모두 포함하지 않는다. 이러한 특징으로 인해서 삼중음성유방암은 세 가지 수용체를 표적으로 하는 표적 치료가 불가능하기 때문에 특별한 치료방법이 없고, 현재 표적 치료를 위한 여러 연구가 활발히 진행되고 있다.
선행 연구에 의해 삼중음성유방암에서 과 메틸화 되어있는 프로모터 영역이 존재하고 CITED4 유전자가 삼중음성유방암 세포주에서 발현이 낮아져 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 유전자의 발현을 조절하여, CITED4를 과 발현 시켰을 경우 항암효과가 나타나는 것이 밝혀졌다. 이에 관한 후속 연구로 CITED4을 과 발현 시켰을 경우, CITED4에 의해서 같이 조절되는 표적 유전자를 찾고자 하였다.
먼저, MDA-MB-231 세포주에서의 CITED4 과 발현 시켰을 때의 RNA-sequencing을 분석하여 같이 증가하는 양상을 보이는 유전자들을 추렸고, ChIP-sequencing을 바탕으로 히스톤 단백질의 변형이 유의미하게 나타나는 유전자를 선별하고, 마지막으로 TCGA 분석까지 통합하여 선별한 결과 최종적으로 ZBTB34 가 선정되었다.
다음으로 CITED4의 후속 표적 유전자로 선별된 ZBTB34의 발현양을 조절하여 항암효과에 대해 알아보았다. CITED4 유전자가 증가하므로 같이 증가된 ZBTB34에 의해서 암의 전이와 세포 생존률이 낮아지는 것을 통하여 항암효과가 있음을 확인하였고, ZBTB34의 발현을 낮추었을 때 암의 표현형이 더 악화되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 CITED4의 발현은 증가시키고, ZBTB34의 발현을 낮추었을 때, 암의 특성을 다시 회복시키는 양상을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 CITED4가 ZBTB34의 발현을 조절함을 통하여 삼중음성유방암의 항암효과를 나타낼 수 있다는 가능성을 제시하였다. 덧붙여서 CITED4와 밀접한 관계를 맺고 있는 EP300과의 관계 또한 파악하여 두 단백질의 상호 연관성을 통해 ZBTB34에 직접적인 영향을 주는 것까지 알 수 있었다.

따라서 본 연구는 CITED4의 기능에 대해 밝히고자 하였고, CITED4와 같이 조절되는 표적 유전자 ZBTB34를 제시함으로써 CITED4가 삼중음성유방암의 새로운 표적 치료의 지표가 될 수 있음을 제안하고자 한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Breast cancer, the world notorious cancer among women, is the second-largest female cancer in Korea. It is infamous for its complicated pattern in pathology and clinical practice. Among all, Triple negative breast cancer accounts for 15~20% of all breast cancer patients. It is widely accepted that poor prognosis and probability of development is relatively high among young age group. Unlike any breast cancer subtypes, Triple negative breast cancer does not contain estrogen receptors(ER), HER2 receptors (HER2), and progesterone receptors (PR) in cell membrane. Since it is almost impossible to target the three receptors, there are no special treatments for Triple negative breast cancer in the status quo and only a few studies for target treatments are being studied.
Previous studies confirmed that the promoter region over methylated in Triple negative breast cancer and CITED4 has decreased in Triple negative breast cancer cell line. Moreover, increased CITED4 had anti-cancer effect. As a follow-up study, I tried to find a target gene that is regulated by CITED4.
To discover the target gene, RNA-sequencing was analyzed with CITED4 in the MDA-MB-231 cell line to select genes that showed an increase in pattern. Finally, ZBTB34 was selected by integrated analysis of ChIP-sequencing and TCGA.
Next, anticancer effect was investigated by controlling the expression level of ZBTB34 selected as a subsequent target gene of CITED4. As the increase of CITED4, it was confirmed that cell proliferation and cell migration were decreased by increased level of ZBTB34. On the other hand, the phenotype of cancer going worse when the expression of ZBTB34 was decreased by CITED4.
In addition, when overexpressed CITED4 and knocked down of ZBTB34, confirmed that the tumor phenotype was recovered again. These results suggest that the possibility of CITED4 can exhibit the anticancer effect of Triple negative breast cancer by regulating the expression of ZBTB34. In addition, the relationship with EP300, which is closely related to CITED4, was also identified and the correlation between the two proteins directly affects to ZBTB34.
Therefore, this study aims to reveal the function of CITED4 and suggests that CITED4 can be an indicator of a new target treatment for Triple negative breast cancer by presenting the target gene ZBTB34 as a biomarker.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction = 1
• II. Materials and methods = 4
• 1. Breast cancer patients Tissues = 4
• 2. Cell Culture = 4
• 3. Transfection = 4
• 4. RNA and Protein extraction = 5
• 5. qRT-PCR = 6
• 6. Western Blotting = 6
• 7. Cell viability Assay = 7
• 8. Transwell Cell Migration Assay = 7
• 9. Immunocytochemistry (ICC) and Microscopy = 8
• 10. TCGA analysis = 8
• 11. Statistical Analysis = 9
• III. Results = 11
• 1. CITED4 is decreased in Triple negative breast cancer = 11
• 2. Integrative analysis of RNA-seq and ChIP-seq data identify target gene by CITED4 overexpression = 15
• 3. CITED4 overexpression increase ZBTB34 expression in TNBC = 18
• 4. ZBTB34 affects cell proliferation and migration in Triple negative breast cancer = 23
• 5. CITED4 exerts oncogenic function via ZBTB34 expression in Triple negative breast cancer = 26
• 6. Transcriptional regulatory mechanism of CITED4 – EP300 protein complex was involved in ZBTB34 regulation in Triple negative breast cancer = 29
• IV. Discussion = 33
• V. Reference = 36