Brefeldin A-inhibited Guanine Exchange Factor 2 regulates dendrite development by controlling Golgi polarization via RhoA/mDia1 signaling cascade in hippocampal neurons

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Proper dendrite development is essential for the establishment of neural circuitry, and Rho GTPases play key roles in regulating dendrite development in neuronal cells. To find novel Rho GTPase regulatory proteins involved in dendrite development, we screened proteins binding to active Rho GTPases from mouse brain lysates. As a result, Brefeldin A-inhibited guanine exchange factor 2, BIG2, was identified as a candidate. BIG2 was highly expressed during early developmental stage and knockdown of the Arfgef2 gene, which encodes BIG2, significantly reduced total dendrite length and the number of dendritic branches. Expression of the constitutively active ADP-ribosylation factor 1, ARF1Q71L, rescued the defective dendrite morphogenesis of Arfgef2-knockdowned neurons, indicating that BIG2 controls dendrite development by activating ARF1. It was also found that BIG2 co-localizes with the Golgi apparatus and is required for Golgi deployment into a major dendrite in cultured hippocampal neurons. Simultaneous overexpression of BIG2 and ARF1 activated RhoA, and treatment of a RhoA activator, LPA, in neurons lacking BIG2 increased the number of cells with dendritic Golgi, suggesting that BIG2 and ARF1 activate RhoA to promote dendritic Golgi polarization. And, mDia1 was identified as a downstream effector of BIG2/ARF1/RhoA axis, mediating Golgi polarization and dendritic morphogenesis. Furthermore, in utero electroporation of Arfgef2 shRNA into mouse embryonic brain proved the in vivo role of BIG2 for Golgi deployment into the apical dendrite. Taken together, this study suggests that BIG2/ARF1/RhoA/mDia1 signaling axis regulates dendritic Golgi polarization and dendrite development in hippocampal neurons.

국문 초록 (Abstract)

신경세포의 구조는 세포 외부의 환경 및 신호들에 의해 역동적으로 변화하며, 이는 신경세포의 기능적 변화로 이어진다. 신경세포의 비정상적인 구조 변화는 인식 장애, 학습장애, 다운 증후군, 자폐증, 정신분열증과 같은 뇌질환의 원인이 된다. Rho GTPase는 세포의 구조를 조절하는 중요한 조절자로 알려져 있으며, 세포 외부의 다양한 신호를 받아들이고 합쳐 액틴을 조절하는 네트워크를 형성하고 있다. 하지만 세포 내 위치와 외부 환경에 따라 세밀하게 조절되어야 하는 Rho GTPase의 조절자에 대한 연구는 충분히 이루어져 있지 않다. 따라서 신경세포의 구조변화를 유발하는 Rho GTPase의 새로운 표적단백질을 발굴하고자 하였고, 본 연구를 통해 BIG2를 새롭게 발굴하였다. BIG2는 뇌 발달 초기에 발현되며, 이를 억제 시켰을 때는 신경세포 수상돌기의 가지와 길이가 줄어든다는 것을 알 수 있었다. BIG2 발현 억제로 인해 수상돌기에 생긴 문제는 활성화된 ARF1의 발현을 유도했을 때 정상적인 형태로 회복되었다. 또한, BIG2는 골지체에 위치하고 있으며, 수상돌기로 뻗는 골지체의 형성을 유도하였다. BIG2와 ARF1은 함께 RhoA의 활성을 촉진시키며, RhoA의 활성화를 유도하는 LPA를 처리하면 BIG2의 발현 억제로 인해 골지체에 생겼던 형태학적 결함이 회복된다는 것을 알 수 있었다. RhoA의 하위단계 조절인자인 mDia1은 BIG2/ARF1/RhoA 과 함께 신경세포의 수상돌기 형태와 골지체의 극성 생장에 관여한다는 것을 알 수 있었다. 더 나아가, 전기 충격을 이용한 마우스의 자궁 내 유전자 삽입 기술로 BIG2의 발현을 마우스 배아의 뇌에서 억제시키면 골지체의 극성 생장이 저해된다는 것을 알 수 있었다. 본 연구를 통해 BIG2/ARF1/RhoA/mDia1 신호전달 체계는 수상돌기와 수상돌기 골지체의 형성을 조절한다는 것을 밝혔다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT i
• LIST OF FIGURES v
• LIST OF TABLES vii
• INTRODUCTION 1
• 1. Neuronal morphology 2
• 1.1. Neuronal actin and microtubule dynamics 3
• 1.2. Rho GTPases 6
• 2. Golgi in neuron 9
• 2.1. Role of Golgi in neuronal morphogenesis 9
• 2.2. Regulators of neuronal Golgi 12
• 3. BIG2 14
• 4. Objectives 17
• MATERIALS AND METHODS 18
• 1. Constructs 19
• 2. Antibodies 20
• 3. Cell culture and transfection 21
• 3.1. 293T cell lines 21
• 3.2. Hippocampal neuron 21
• 4. RhoGTPases associated proteins pull down assay and mass analysis 22
• 5. Small GTPase Activity Assay 23
• 6. Immunoblots 23
• 7. Immunocytochemisty 24
• 8. In utero electroporation 24
• 9. Immunohistochemistry 24
• 10. Image acquisition 25
• 11. Statistics 25
• RESULTS 26
• 1. BIG2 is a novel interactor of RhoA. 27
• 2. BIG2 is required for dendrite development 34
• 3. BIG2 regulates dendrite development via ARF1 39
• 4. BIG2 is required for polarized distribution of the Golgi 41
• 5. BIG2 regulates Golgi polarization via RhoA signaling cascade 45
• 6. mDia1 is required for dendrite development and acts as a downstream effector of RhoA to control Golgi polarization. 51
• 7. BIG2 controls Golgi positioning in the cell body of hippocampal neuron during early developmental stage. 58
• 8. BIG2 affects neuronal migration and Golgi polarization in vivo. 60
• DISCUSSION 63
• REFERENCES 68
• SUMMARY (IN KOREAN) 78
• ACKNOWLEDGEMENTS (IN KOREAN) 80