Impaired Expression of Integrin alpha-4 Subunit in Cultured Mast Cells Derived from Mutant Mice of mi/mi Genotype

국문 초록 (Abstract)

마우스 第6染色體의 mi遺傳子座에는 basic-helix-loop-helix-leucine zipper형 轉寫因子인 mi transcription factor (MITF)이 코드되어 있다. mi遺傳子座에 돌연변이를 일으킨 mi/mi돌연변이 마우스의 피부에는 정상마우스에 비해 비반세포 數의 감소와 分化異常을 보인다. mi/mi 마우스에서 발현하는 變異型 MITF는 DNA結合能과 核移行能의 異常에 의해 특정유전자에 대한 轉寫活性能이 현저히 감소 또는 소실되어 있다. 우리들은 이전에 野生型마우스由來 培養비반세포(+/+ CMC)의 비해 mi/mi 마우스由來 培養비반세포 (mi/mi CMC)의 纖維芽細胞에 대한 接着能이 현저히 저하되어 있는 것을 보고하였다. 최근에 비반세포의 接着에 인테그린이 중요한 역할을 하고 있음이 보고됨에 근거하여 mi/mi CMC에 있어 인테그린 발현이 저하되어 있을 가능성이 높을 것으로 예측되어 그에 관하여 검토하였다.
+/+ CMC와 mi/mi CMC에 있어서 인테그린 유전자의 발현을 RT-PCR법으로 해석하였다. 비반세포에 발현하는 인테그린들 중에서 인테그린 알파4亞型의 발현이 +/+ CMC에 비해 mi/mi CMC에서 현저히 저하되어있었다. 그리고 +/+ CMC에서는 인테그린 알파4아형遺傳子 발현이 培養개시후 4주째에 최고가 되고, 그 이후에는 감소하지만, mi/mi CMC에서는 培養후 어느 시기에서도 전혀 발현하지 않았다. 알파4아형의 특이적인 抗體를 이용한 FACS에 의한 解析에서도 RT-PCR법에서와 동일한 결과를 얻었다. 인테그린 알파4亞型의 리간드인 VCAM-1을 强制로 發現시킨 CHO細胞株에 대한 接着率도 +/+ CMC에 비해 mi/mi CMC에서 크게 저하하였다.
MITF에 의한 관련성을 조사하기 위해 인테그린 알파4亞型遺傳子의 프로모터領域을 해석하였다. MITF와 結合한다고 알려진 鹽基配列 CACTTG의 존재를 확인하고, CACTTG motif를 포함하는 프로모터領域을 Luciterase 遺傳子의 上流에 揷入하여, 正常型 MITF를 발현하는 IC-2細胞株에 도입하였다 그 결과 Luciferase活性이 증가하였다. CACTTG motif를 消失 또는 變異시키면 Luciferase활성의 상승은 보이지 않았다. CACTTG motif를 포함한 Reporter Plasmid를 正常型 MITF와 동시에 導入하면 Luciferase活性은 상승하지만, 變異型 MITF와 함께 導入하면 Luciferase活性은 상승하지 않았다. 또 EGMSA법에 의한 실험에서 正常型 MITF가 CACTTG motif에 結合함을 알 수 있었다.
이상의 결과로서 mi/mi마우스由來 培養비반세포에는 인테그린 알파4亞型의 발현이 저하되어 있고, 또 정상형 MITF가 인테그린 알파4亞型遺傳子의 프로모터領域에 존재하는 CACTTG motif를 통하여 轉寫를 활성화 한다고 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = ⅲ
• LIST OF FIGURES AND TABLE = ⅳ
• LIST OF ABBREVIATIONS = ⅴ
• Ⅰ. INTRODUCTION = 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 2
• 1. Mice
• 2. Cells
• 3. Semiquantitative RT-PCR
• 4. Flow cytometry
• 5. Construction of expression plasmids
• 6. Adhesion assay
• 7. Promoter of integrin alpha-4 subunit gene and reporter plasmids
• 8. Transfection of reporter plasmids and Luciferase assay
• 9. EGMSA
• Ⅲ. RESULTS = 7
• 1. Impaired expression of integrin alpha-4 subunit in mi/mi CMCs = 7
• 1-1 The expression of intergrin genes
• 1-2 The surface expression of integrin alpha-4 protein
• 1-3 Effect of rmSCF on the expression of integrin alpha-4 protein
• 1-4 The adhesion of CMCs
• 2. Transactivation of integrin alpha-4 subunit gene by + -MITF = 15
• 2-1 The luciferase activity
• 2-2 The binding of MITFs to the oligonucleotide
• Ⅵ. DISCUSSION = 21
• Ⅴ. REFERENCES = 24
• Acknowledgement = 31
• Abstract in Korean = 32