Development of complex RNA interference triggering structures for therapeutic applications

국문 초록 (Abstract)

RNA interference (RNAi)는 두가닥으로 이루어진 RNA (double stranded RNA)에 의해 해당 염기서열과 특정한 방식으로 표적 유전자의 발현을 억제시키는 세포 내 메카니즘이자 기술이다. RNAi는 1998년에 Andrew Fire와 Craig Mello에 의해 꼬마선충에서 처음으로 발견되었으며 그들의 공로가 인정되어 2006년에는 노벨 생리의학상을 수상하기도 하였다. 또한 RNAi가 합성된 siRNA에 의해 포유동물 세포에서도 효과적으로 일어난다는 사실이 보고되면서 이 분야의 연구는 매우 활발히 진행되었다. 표적 유전자에 대한 siRNA를 손쉽게 디자인 할 수 있고 이를 통해 특정 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에 RNAi 기술은 유전자 기능 연구, genome-wide 연구, 신약 개발, 질병 치료 등 다양한 분야에 응용될 수 있는 매우 강력한 기술이다.
하지만 siRNA에 의한 몇가지 Off-target effect가 발견되면서 RNAi분야는 새로운 국면을 맞이하게 되었다. SiRNA의 guide strand의 일부 염기 서열이 표적이 아닌 다른 유전자의 염기서열과 일부분이 일치하여 원하지 않는 유전자 발현 억제를 이끌어 내기도 하며, passanger strand에 의한 유전자 발현 억제 현상 역시 off-target effect의 예이다. 또다른 off-target effect는 siRNA 자체 혹은 세포 내로 전달해 주기 위해 사용되는 delivery vehicle이 원하지 않는 선천성 면역 반응을 일으키는 현상이다. 이러한 다양한 off-target effect들을 줄이거나 또다른 장점들을 부여하기 위해 다양한 연구들이 진행 및 보고되고 있으며 대표적으로 chemical modification (화학적 변형)이나 structural modification (구조적 변화)을 siRNA에 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 이러한 modification들은 표적 유전자의 발현 억제 효율 증가, off-target effect 감소, 세포 내 전달 효율 증가 등의 장점을 부여할 수 있다고 보고 되고 있다.
본 논문에서는 structural modification을 도입함으로써 기존의 siRNA보다 더 나은 장점들을 갖는 복잡한 형태의 RNAi 유도 구조체들에 대한 연구 결과들을 설명하고 있다. 하나의 유전자를 표적으로 삼는 RNAi 유도 구조체는 치료제로의 개발에 있어서 한계가 있을 수 있다. 예를 들어 바이러스의 경우, 유전자 변이가 쉽게 일어나기 때문에 자체적으로 하나의 유전자를 표적으로하는 RNAi 기반 치료제에 대해 쉽게 저항성을 갖게 된다. 최근 연구 결과에 의하면 유전자 변이가 일어난 바이러스나 암세포는 siRNA와 표적 유전자와의 결합에 있어서 열역학적 안정성을 변화시키고 이를 통해 RNAi 메커니즘을 회피하거나 감소 시킬 수 있다고 설명하고 있다. 그러므로 암이나 바이러스에 대한 RNAi 기반 치료제의 개발을 위해서는 동시에 여러 개의 유전자를 표적으로 하는 전략을 필요로 한다.
본 논문에서는 여러 개의 유전자를 표적으로 하는 muti-target RNAi 유도 구조체들인 Tripodal interfering RNA (T-tiRNA, 표적유전자 3개), tripartite interfering RNA (tiRNA, 표적유전자 3개), quadruple interfering RNA (qiRNA, 표적유전자 4개)에 대한 연구 결과를 소개하고 있다. 이들은 3~4개의 유전자를 동시에 표적으로 하는 multi-target gene silencing이 가능하며, 뿐만 아니라 PEI와 같은 cationic delivery vehicle과 complex를 이룰 때 기존의 siRNA보다 세포 내로 효과적으로 전달이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 효과적인 세포 내 전달은 siRNA보다 우수한 유전자 억제 효과를 유도하는 원인이 된다는 사실도 확인하였다. RACE assay나 RISC incorporation assay 결과는 이러한 muti-target RNAi 유도체들이 비특이적인 방식이 아니라 RNAi 메커니즘을 통해서 표적 유전자의 발현을 특이적으로 억제 시킨다는 것을 확인 시켜준다.
마지막으로 RNAi 활성과 면역유도 활성을 동시에 갖는 bi-functional RNAi 유도 분자 구조체인 Long interfering RNA (liRNA)의 연구 결과가 본 논문에 소개 되었다. 기존의 연구 결과에 의하면 long dsRNA는 PKR과 OAS의 활성을 일으켜 세포의 mRNA를 분해를 유도하고 다양한 면역 관련 cytokine들의 발현을 이끈다고 알려져 있다. 이러한 long dsRNA의 특징을 이용하여 임상에서 뇌종양의 성장을 효과적으로 저해하거나 cell specific delivery를 가능하게 하여 효과적으로 암세포의 성장을 억제시켰다라는 내용의 논문이 이미 보고 되어있다. 이와 같은 연구 결과를 토대로 RNAi와 면역유도 반응에 대한 활성을 동시에 갖는 RNA 분자 구조체를 만들기 위해 guide strand와 passanger strand의 염기서열을 siRNA처럼 표적 유전자를 갖도록 하는 한편 annealing이 이루어지면 long dsRNA 구조가 만들어지도록 liRNA를 디자인하였다. liRNA는 기대했던 것과 마찬가지로 두가지 기능에 의한 시너지 효과를 나타내며 RNAi 활성만을 갖는 siRNA나 면역유도반응 활성만을 갖는 long dsRNA보다 효과적으로 암세포의 성장을 효과적으로 저해하는 결과를 보여주었다.
이렇듯 본 논문에서 소개한 복잡하고도 다양한 RNAi 유도 구조체들은 기존의 siRNA가 가지지 못한 다양한 장점들을 가지고 있다. 그러므로 이러한 구조체들을 활용한다면 RNAi 기반 치료제로의 개발에 있어서 기존의 siRNA보다 잠재성이 크며 보다 확실한 대안이 될 수 있을 것이라고 기대한다.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER 1: Overview of RNA interference (RNAi) 1
• 1-1. RNA interference (RNAi) : Discovery, Mechanism , Application 1
• 1-2. Unexpected problems and solutions for RNAi based therapies 6
• 1-3. References 13
• CHAPTER 2: Multi-gene silencing by branched RNA structure with linker molecule : T-tiRNA 18
• 2-1. Introduction 19
• 2-2. Results and Discussions 22
• 2-3. Materials and Methods 49
• 2-4. References 52
• CHAPTER 3: RNA interference (RNAi) triggering tripartite RNA structure without linker molecule : tiRNA 58
• 3-1. Introduction 59
• 3-2. Results and Discussions 62
• 3-3. Materials and Methods 86
• 3-4. References 92
• CHAPTER 4: Cross-shaped RNA interference (RNAi) trigger structures : qiRNA 97
• 4-1. Introduction 98
• 4-2. Results and Discussions 100
• 4-3. Materials and Methods 114
• 4-4. References 120
• CHAPTER 5: Immunostimulatory long doublestranded RNA (dsRNA) structure with the ability to trigger RNAi-mediated specific target gene silencing : liRNA 124
• 5-1. Introduction 125
• 5-2. Results and Discussions 128
• 5-3. Materials and Methods 144
• 5-4. References 146
• Summary in Korean 150
• Acknowledgment 153
• Curriculum Vitae 156