임상검체에서 분리된 Enterobacter cloaceae의 광범위 β-Lactam 항균제 감수성 양상 = Antimicrobial Susceptibilities of Enterobacter cloaceae Isolates from Clinical Specimens to Broad-Spectrum β-Lactam Antibiotics

국문 초록 (Abstract)

연구배경 및 목적: Enterobacter cloaceae는 장내세균 속(Family Enterobacteriaceae)에 속하는 그람음성간균으로, 병원감염을 유발하는 중요 원인균 중의 하나이다. 이 세균은 Staphylococcus aureus, Escherichia coli 등 중요 병원감염 원인균에 비해서 감염을 유발하는 빈도는 낮지만, 임상적으로 더 위중한 감염을 일으킨다. 근래 임상검체에서 분리된 E. cloaceae의 광범위 β-lactam 항균제에 대한 내성율이 높아지고 있어서, 임상적으로 심각한 위협으로 간주되고 있다. 이에 이 연구에서는 E. cloaceae 감염증의 치료지침을 마련하고, 내성세균 감염증 치료제 개발에 기초가 되는 자료를 제공하고자, 부산의 한 대학병원에서 분리되는 E. cloaceae를 대상으로 광범위 β-lactam 항균제에 대한 내성 현황을 조사하고, 그 내성기전을 규명하고자 하였다.
연구대상 및 방법: 1999년에 고신의료원 환자의 임상 검체에서 분리된 E. cloaceae를 대상으로 디스크 확산법으로 항균제 감수성을 시험하였다. Cefotaxime 내성균주를 대상으로 double disk synergy를 시험하여서 extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 생성균주를 선별하였으며, 한천희석법으로 최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 또한 imipenem 내성균주를 대상으로 EDTA-double disk synergy를 시험하여서 metallo-β-lactamase 생성 여부를 확인하였으며, 그 유전형의 규명을 위해서 중합연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 및 염기서열분석을 시행하였다.
결과: 시험기간 중 총 158주의 E. cloaceae가 임상검체에서 분리되었다. 이들 균주의 cefotaxime에 대한 내성율은 42%였고, imipenem에 내성인 균주도 1주 분리되었다. Cefotaxime 내성균주를 대상으로 double disk synergy를 시험하였으며, 이 중 21% (9/42)가 양성이어서 ESBL 생성균주로 판명되었고, imipenem 내성주 1주를 제외한 double disk synergy 음성 32주는 탈억제에 의해서 AmpC β-lactamase를 과량생성하는 균주로 추측되었다. Impenem 내성주 (E. cloaceae KU680, MIC 4 μg/ml)는 EDTA-double disk synergy 양성이어서 metallo-β-lactamase 생성균주로 판명되었다. E. cloaceae KU680의 내성 유전형 규명을 위해서 IMP-1, VIM-1 및 VIM-2 검출을 위한 PCR을 각각 시행하였으며, VIM-2 PCR에서만 양성이었다. Metallo-β-lactamase를 생성하는 E. cloaceae는 아직 세계적으로 보고된 예가 없는 것으로 생각되어서 그 염기서열을 Genbank에 등록하였다 (Genbank accession No. AF305559).
결론: 이상의 연구에서 고신의료원에는 광범위 β-lactam 항균제에 내성인 E. cloaceae가 흔하며, 그 대부분은 탈억제에 의한 AmpC β-lactamase 과량생성 혹은 ESBL 생성에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한 metallo-β-lactamase 생성에 의해서 imipenem에 대한 내성을 획득한 균주도 등장하였으며, 그 감염증을 치료할 수 있는 약제가 아직 개발되지 않았기 때문에, 이 세균은 임상적으로 매우 위협적인 존재로 보인다. 이들 광범위 β-lactam 항균제에 내성인 세균의 만연을 감시 혹은 방지하기 위한 병원감염 관리대책의 마련이 필요하며, metallo-β-lactamase 생성에 의해서 imipenem에 대한 내성을 획득한 세균 감염증의 치료를 위한 새로운 항균제의 개발이 절실한 것으로 생각되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Enterobacter cloaceae is a gram negative rod and is classified in the family Enterobacteriaceae, and this microorganism is a well-recognized nosocomial pathogen. Although less prevalent than other etiologic agents, such as Staphylococcus aureus and Escherichia coli, E. cloaceae cause significant infection. In recent years, E. cloaceae isolates with resistance with broad-spectrum β-lactam antibiotics have increased, and it is considered to be a serious clinical problem. The purposes of this study were to investigate the prevalence of E. cloaceae strains with resistance to broad-spectrum β-lactam antibiotics isolated from patients of Kosin Medical Center, Pusan, and to determine the mechanisms of resitance to these drugs.
Materials and Methods: Nonduplicated clinical isolates of E. cloaceae were collected during 1999 in Kosin Medical center, Pusan. Antimicrobial susceptibility was tested by disk diffusion method. Cefotaxime-resistant strains were examined for extended-spectrum β-lactamase (ESBL) by double disk synergy test. Minimal inhibitory concentrations (MIC) were determined by agar dilution method. A imipenem-resistant strain was examined for metallo-β-lactamase by EDTA-double disk synergy test. For detection of IMP-1, VIM-1, and VIM-2 genes, polymerase chain reactions (PCR) were performed, and the DNA sequences of VIM-2 gene were determined by using dideoxy-chain termination method.
Results: During 1999, 158 strains of E. cloaceae were isolated from patients in Kosin Medical Center. Forty-two percents of E. cloaceae isolates were resistant to cefotaxime, and an isolate (KU680) was resistant to imipenem. Among the isolates with resistance to cefotaxime, 21% (9/42) of isolates showed positive results in double disk synergy test. E. cloaceae KU680 was resistant to impenem (MIC, 4 μg/ml), and showed positive result in EDTA-double disk synergy test. PCRs for determination of the metallo-β-lactamase gene of E. cloaceae KU680 were performed, and this strain showed positive result in PCR for amplification of VIM-2 gene. E. cloaceae strain producing metallo-β-lactamase is the first case report in the world (Genbank accession No. AF305559).
Conclusion: Many of E. cloaceae strains isolated from patients in Kosin Medical Center were resistant to cefotaxime by producing ESBLs or overproducing AmpC β-lactamase. An an E. cloaceae strain acquired resistance to imipenem by producing VIM-2 metallo-β-lactamase. Antimicrobial agents, which can be used for the treatment of infections by metallo-β-lactamase- producing strains, are not developed yet. So it is concluded that prevention of hospital infection and development of new antimicrobial agents for the treatment of infection by metallo-β-lactamase-producing microorganisms are needed.

목차 (Table of Contents)

• 그림 및 표 차례 = ⅱ
• 국문 요약 = ⅲ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 3
• 1. E. cloaceae의 분리 및 동정 = 3
• 2. 항균제 감수성 시험 = 3
• 3. Double disk synergy 시험 = 3
• 4. 최소억제농도 측정 = 4
• 5. EDTA-double disk synergy 시험 = 4
• 6. 중합연쇄반응을 이용한 metallo-β-lactamase 유전형 시험 = 4
• 7. 염기서열 분석 = 5
• Ⅲ. 결과 = 6
• 1. E. cloaceae의 항균제 감수성 양상 = 6
• 2. Double disk synergy test = 6
• 3. MIC = 8
• 4. Imipenem 내성주 = 9
• Ⅳ. 고찰 = 11
• Ⅴ. 결론 = 15
• 참고 문헌 = 16
• 영문 초록 = 20