면역거부반응 유전자를 제거한 형질전환돼지 유래 무세포이종진피의 개발 및 평가 = Development and evaluation of xenogeneic acellular dermal matrix using genetically modified transgenic porcine skin to reduce immune rejection in human transplantation

국문 초록 (Abstract)

피부는 인체에 있어서 가장 큰 장기이며 다양한 생리적 기능을 수행함으로써 외부 환경으로부터 인체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 피부는 물리적, 화학적인 외부의 다양한 원인에 의해 손상될 수 있다.
일반적으로 손상 범위가 작은 경우는 자연 치유가 가능하지만, 손상의 범위 넓은 경우 자연 치유가 어렵다.
이 경우는 다양한 수술적 방법으로 이용하여 손상된 피부를 재건하는데, 때에 따라 진피대체물을 사용한다. 진피대체물은 동종 및 이종의 원재료를 이용하여 손상된 피부를 대체할 수 있도록 제작된다.
무세포이종진피의 경우 무세포화가 완벽하게 이루어지지 않으면 감작 반응에 의한 면역 거부가 발생할수 있고 결과적으로 무세포이종진피를 추가로 사용하였을 경우 면역 거부 반응으로 정상적인 치료가불가능할 수 있다.
이러한 문제를 해결하고자 본 연구에서는 형질전환돼지의 피부를 이용한 무세포이종진피를 제작하였으며 임상용으로 사용 가능 여부를 판단하고자 하였다. 연구에 사용된 형질전환돼지는 GGTA1, CMAH,
B4galNT2, iGb3s의 유전자를 변형하여 면역 거부를 줄이고자 하였다. 물리화학적 시험을 통해 인장강도수분 흡수율을 확인하였고, 세포 시험을 통해 세포가 무세포이종진피 내부로 이동 및 성장 가능 여부를파악하였다. 동물시험에서 무세포이종진피 이식 후 면역 염색 결과를 바탕으로 초기 염증 반응 및 감염성 등에 대한 안전성을 확보하였고 15주 동안 이식한 결과를 바탕으로 무세포이종진피의 분해 시간등을 확인함으로써 기능적으로 안전성을 증명하였다. 추후 영장류를 이용한 전임상 시험을 임상 적용에적합성을 확인할 예정이며 결과에 따라 제품으로 개발이 가능할 것으로 판단된다.
화상, 무세포이종진피, 피부이식, 형질전환돼지, 진피대체물

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• 1. 서론 1
• 2. 재료 및 방법 7
• 1) 형질 전환 돼지 7
• 2) 무세포이종진피 제작 시약 8
• 3) 형질전환 돼지 유래 무세포이종진피의 제작 과정 8
• 4) 전자현미경 12
• 5) 인장강도 12
• 6) 수분 흡수율 12
• 7) Immune histochemistry 13
• 3. 결과 15
• 1) 무세포이종진피 제작 15
• 2) 전자현미경 이미지 16
• 3) 인장강도 17
• 4) 수분 흡수율 17
• 5) In vitro test 17
• 6) In vivo test 18
• 4. 고찰 20
• 5. 참고문헌 22
• 그림 28
• 표 45
• Abstract 47
• 그림목차
• 그림1 피부 구조 모식도 28
• 그림2 표피 세포를 구성하는 5개의 층 28
• 그림3 사용되고 있는 진피대체물의 분류와 예 29
• 그림4 돼지 피부에서 표피 및 기타 조직이 분리되는 과정의 모식도 29
• 그림5 모근 제거 모식도 30
• 그림6 수분 흡수율 측정을 위한 실험 모식도 및 수분 흡수율 측정 방법 30
• 그림7 SD Rat에 무세포이종진피를 이식하기 위한 계획 31
• 그림8 돼지 채취 사진 31
• 그림9 무세포이종진피 제작을 위해 채취된 돼지 피부 32
• 그림10 표피 조직 제거 전후 이미지 32
• 그림11 모근 제거 과정 33
• 그림12 살균 과정을 마친 후 LB Broth에서 배양한 무세포이종진피의 이미지 33
• 그림13 동결건조 조건표 34
• 그림14 동결건조 후 수분 측정 결과 34
• 그림15 포장이 완료된 QKO 돼지 유래 무세포이종진피의 이미지 35
• 그림16 멸균 선량 확립 결과의 이미지 35
• 그림17 전자현미경 사진 36
• 그림18 제작된 무세포인공진피의 인장강도를 수화/건조 조건 별로 측정결과 37
• 그림19 수화 및 건조 상태로 측정된 무세포이종진피의 인장강도 결과의 수치 데이터 37
• 그림20 수분 흡수율을 그래프로 도식화 38
• 그림21 제작된 무세포이종진피의 Human Fibroblast를 이용한 세포 증식율 비교 38
• 그림22 무세포이종진피의 세포 성장률 증식을 향상 39
• 그림23 Surgical knife를 이용한 표피 쪽 mesh 구조 형성 및 그에 따른 세포 증식 시험 40
• 그림24 Surgical knife를 이용한 표피/진피 양방향 mesh 구조 형성 및 그에 따른 세포 증식 시험 41
• 그림25 제작된 무세포이종진피와 상용 제품의 이식 후 2, 4, 8, 15주 차 이미지 42
• 그림26 SD Rat을 각 일정에 맞추어 희생 조직을 고정 후 H&E 염색 결과 43
• 그림27 SD Rat을 각 일정에 맞추어 희생 조직을 고정 후 MT 염색 결과 44
• 표목차
• 표1 형질전환돼지의 Knock-out 개체별 유전자 변형 타입 45
• 표2 Bioburden 실험을 위한 배양 조건 45
• 표3 멸균 확인 시험 결과 45
• 표4 무세포이종진피의 수분 흡수율 측정 결과 46