SNP 유도된 SH-SY5Y 세포주에서 광 조사에 의한 세포 사멸 억제에 관한 연구 = Anti-apoptotic pathway of LED irradiation on SNP induced SH-SY5Y neuroblastoma cell lines

국문 초록 (Abstract)

일산화질소(NO)는 뇌의 허혈성 손상, 수초 용해성 질환 및 퇴행성 신경질환에서 신경세포 손상에 관여하지만 일산화질소가 직접적으로 신경 독소로서 작용 되는 것이 아니라 과산화물(O₂^(-))과의 작용에 의해 Peroxynitrite(ONOO^(-))를 형성하여 세포내부에서 산화 손상(oxidative damage)을 주는 것으로 알려져 있다.
ONOO^(-) 는 세포에서 직접적인 산화제로 작용하거나, ONOO^(-)의 분해를 통해 생성된 라디칼에 의한 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 그러나 ONOO^(-)가 세포사멸을 유도하는 메카니즘은 아직 불분명하며, 여러 보고에 따르면 연속적인 활성 산소(ROS)의 생성이 영향을 미칠 것이라고 추측되어 지고 있다.
본 연구의 목적은 특정 파장의 광 조사를 이용하여 과산화물의 제거를 통한 ONOO^(-)의 생성 저해가 세포 사멸 억제에 관여하는 기전을 연구하는 것이다. 이를 위해 SH-SY5Y 세포주에 일산화질소의 공여체인 Sodium Nitroprusside(SNP)로 세포사멸을 유도하였고, 이의 억제를 위해 특정 파장의 광조사를 시행하였다. MTT분석, DNA 분절분석, 유세포 분석, 단백질 분석 및 caspase-3,-9활성 분석을 시행하였다. 또한 NO의 변화를 관찰하기 위하여 NO의 방출량과 ROS 량 및 ONOO^(-)을 측정하였다.
실험결과, SNP가 처리군에서 세포증식은 대조군에 비해 50%정도로 감소하였다. 그리고 광 조사를 시행 후 특히, 590nm의 광조사군에서 가장 높게 약 80%까지 회복되었다. 유세포 분석과 DNA 분절분석 결과, SNP가 처리된 군에서 세포 사멸이 관찰되었으나 590nm 광조사 군에서는 세포사멸 양상이 감소하였다. NO 방출량과 총ROS 량 SNP 처리에 따라 모두 증가 되었으나, 590nm 광조사 그룹에서는 NO의 방출량이 높게 유지되었음에도 불구하고, 총 ROS 량은 감소되었다. 또한 SNP의 처리에 따라 유도된 cytochrome C의 방출은 590nm 광조사에 의해 저해 되었고, 이에 따라 caspase-3와 -9의 활성은 현저하게 감소되었다.
위의 결과를 종합해 보았을 때, 590nm의 광조사가 NO에 의해 유도된 미토콘드리아 의존성 세포 사멸 경로를 차단하여 신경세포사멸을 차단하였다고 보여주어, 광조사가 신경세포의 퇴행성 질환의 진행을 억제하는데 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The nitric oxide (NO) is a major factor contributing to the loss of neurons in ischemic stroke, demyelinating diseases, and other neurodegenerative disorders. But it is known that NO is not functioning as a direct neurotoxin. NO combined with superoxide (O₂^(-)) by the diffusion-controlled reaction, formed a peroxinitrite anion (ONOO^(-)), and this species has been shown to contribute to oxidative signaling and damage. ONOO^(-) stimulates apoptosis in many cell types, whether ONOO^(-) acts directly as an oxidant or the induction of apoptosis is because of the radicals derived from ONOO^(-) decomposition. But, the mechanism by which ONOO^(-) induces apoptosis is unclear although subsequent formation of reactive oxygen species (ROS) has been suggested.
The aim of present study is to investigate the anti-apoptotic pathway by inhibition of ONOO^(-) synthesis through scavenging of ROS with specific wavelength of light irradiation. The present study was investigated the anti-apoptotic effect by specific wavelength of irradiation in Sodium Nitroprusside (SNP) treated SH-SY5Y cells, using by MTT, DNA fragmentation, flow cytometric assay, and caspase assay. Also, NO release and ROS level was measured in order to observe the changes of NO released involved in radicals by Griess reaction analysis and DCF-DH.
Results showed that the cell viability was reduced to around 60% of control by SNP treatment, and relieved of 80% by 590nm irradiation. The apoptotic cells were observed by flow cytometric and DNA fragmentation assay in SNP-treated group, but to be reduced in 590nm irradiation group. Released NO and ROS level were increased after SNP treatment but only ROS level was decreased in 590nm irradiation group, in spite of high NO concentration by SNP. Also, cytochrom C release was found in SNP-treated group but not in 590nm irradiation group, followed by the decreased expression of caspase-3 and -9.
Taken together, 590nm irradiation can protect neuronal death through by blocking NO-induced mitochondrial apoptotic pathway. Also, it suggests that specific wavelength of irradiation could be used for prevention of neurodegenerative disorder.

목차 (Table of Contents)

• Abstract = 1
• Introduction = 3
• Material & Method = 5
• Result = 10
• Discussion = 20
• Conclusion = 24
• Reference = 25
• 초록 = 28