Discovering Human Chemokine (C-C motif) receptor 8-binding Peptides Approached by Phage Display Biopanning and Targeted Next-generation Sequencing

국문 초록 (Abstract)

종양 침윤 조절 T 세포(Ti-Treg)를 제어하는 것이 면역
항암치료에 중요하다고 알려져 왔다. 지금까지 개발된 Ti-Treg
조절 약물은 자가면역질환 등의 부작용이 많기 때문에
CCR8(케모카인 수용체 8)과 같이 Ti-Treg 에 특이적으로
존재하는 마커를 표적으로 하는 것이 필요하다.
CCR8을 표적으로 하는 펩타이드 발굴을 위해 파지 디스플레이
바이오패닝(phage display bio-panning) 및 표적 차세대
시퀀싱(targeted next-generation sequencing)을 통해 펩타이드
후보군을 풀링한 후, 펩타이드-단백질 바인딩 예측 및 ccr8 발현
세포주 모델에서의 이들 후보군의 바인딩 양상을 분석하였다.
바이오패닝은 C7C 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를
이용하여 4회에 걸쳐 진행하였으며, 각각의 바이오패닝에서 얻은 파지 풀을 표적 차세대 시퀀싱으로 분석하고, 이들 데이터를
계층적 방법으로 정량적 클러스터링하였다.
4차 바이오패닝에서 얻은 총 336개의 결합 펩타이드
후보군(≥10 read count)을 최종 분석하였고, 이들 후보군을
클러스터 A(n=135), B(59), C(142)로 분류하였다. 각 라운드의
Z 스코어 변화에 따라 각 클러스터의 펩타이드 서열을 정렬한
결과, EKMVATH, HNYHNAT 및 DGRPDRA 의 컨센서스 서열이
각 클러스터의 주요 그룹을 대표하였다. in silico 예측 모델은
이러한 펩타이드가 CCL1과 유사한 패턴으로 CCR8의
transmembrane subpocket 에 결합할 수 있다는 통계적 확률을
보여주었다. 또한, CCR8이 발현된 Jurkat 세포에서 유세포 분석을
실시한 결과 이들 펩타이드가 CCR8에 결합할 수 있음을 확인하여
대조군에 비해 유의한 차이를 보였다.
본 연구에서는 기존의 방법과 비교하여 펩타이드 라이브러리의
많은 후보물질을 표적 NGS 와 정량적 클러스터링 방법을 사용하여
높은 처리량으로 처리하였다.
세포 모델에서 펩타이드-단백질 결합을 예측하고 스크리닝한
결과, 이들 후보물질이 CCR8을 발현하는 Treg 을 타겟으로 하는
약물 설계를 위한 표적 물질로 사용될 수 있음이 시사되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

It has been known that tumor-infiltrating regulatory T cells (Ti-Treg) control is important for anti-cancer immunotherapy. Ti-Treg modulating drugs developed so far have many side effects, so it is necessary to target a marker specifically present in Ti-Treg, such as chemokine (c-c motif) receptor 8 (CCR8). For discovering peptides targeted to CCR8, we tried to pool peptide candidates through phage display bio-panning and targeted next-generation sequencing, and then analyze these candidates in the computational peptide-protein prediction and ccr8 expressed cell line model.
Biopanning was conducted over four rounds using the C7C phage display peptide library, and the phage pool obtained from each biopanning was analyzed by targeted next-generation sequencing (NGS), and these data were quantitatively clustered by the hierarchical method.
A total of 336 binding peptide candidates (≥10 read count) obtained from the 4th biopanning were finally analyzed, and these candidate groups were classified into clusters A (n = 135), B (59), and C (142), according to the Z score change for each round. The peptide sequences of each cluster were aligned, and the consensus sequence of EKMVATH, HNYHNAT, and DGRPDRA represented the main groups of each cluster. An in silico prediction model exhibited that there was a statistical probability that these peptides could bind to the transmembrane subpocket of CCR8 in a pattern similar to that of CCL1. Also, as a result of flow cytometry in CCR8-expression Jurkat cells the measuring, it was found that these peptides could bind to CCR8, displaying a significant difference compared to the control group.
In this study, compared to the conventional methods, a lot more candidates from the peptide library were processed with high throughput using targeted NGS and a quantitative clustering method.
As a result of predicting and screening peptide-protein bonds in the cell model, it was suggested that these candidates could be used as effective materials targeting CCR8 for drug design in Ti-Treg.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction ----------------------------------------------------- 1
• Ⅱ. Materials and methods ---------------------------------------- 4
• Ⅲ. Results ------------------------------------------------ 11
• Ⅳ. Discussion ------------------------------------------------ 35
• Ⅴ. Conclusion ------------------------------------------------ 40
• Ⅵ. References ------------------------------------------------ 41
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