폴리페놀 화합물의 플라즈마와 방사선 처리에 의한 구조 및 생리활성 변화 평가 = Evaluation of Polyphenolic Compounds of Structures and Bioactivities Changes by Plasma and Gamma-ray Treatment

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Polyphenolic compounds are widely available in natural products. Polyphenol compounds are particularly easy to ingest through food, and are contained in vegetables and fruits. In addition, polyphenol compounds exhibit various physiological activities and serve as excellent antioxidant. Studies on the structural transformation of polyphenol compounds have been continued, and various oxidized products have been reported mainly by using polyphenol oxidase enzyme and microorganisms. However, structure modification studies using plasma have been limited, and structure modification research using gamma rays has been continued. But, studies on the isolation and identification of the structure modification converted compounds using gamma irradiation and the evaluation of efficacy have been limited.
In this study, structure modification of natural polyphenol compounds phloridzin, (+)-catechin, rutin and rosmarinic acid was confirmed by plasma treatment and gamma irradiation. The anti-diabetic and anti-obesity properties of the degraded polyphenol compounds were measured based on α-glucosidase and pancreatic lipase inhibitory activities. The structure modified compounds were isolated and purified by reverse phase HPLC and various column chromatography. The structures of these compounds were confirmed by interpretation of nuclear magnetic resonance(1H-, 13C, two-dimensional NMR), UV, [α]D and FABMS spectroscopic data. Plasma-induced structural changes in dihydrochalcone phloridzin resulted in the isolation of three new methylene-bridged dihydrochalcone dimers, methylenebisphloridzin(1), deglucosylmethylenebisphloridzin(2) and methylenebisphloretin(3), along with known compound phloretin(4). The new phloretin dimer, mehtylenebisphloreitn(3) exhibited significantly enhanced inhibitory effects against α-glucosidase and pancreatic lipase with IC50 values of 4.2±0.9 μM and 5.2±0.5 μM, respectively. Also, methylenebisphloreitn(3) connected by a methylene linkage exhibited significantly improved anti-adipogenic properties against of 3T3-L1 preadipocyres compared the parent phloridzin. The flavan-3-ol (+)-catechin was treated with plasma to afford two new methylene-bridged flavan-3-ol dimers, compound(5) and compound(6), along with the known compounds, bis 8, 8'-catechinylmethane(7) and bis 6, 8'-catechinylmethane(8). The new flaval-3-ol trimer compound(5) exhibited significantly enhanced inhibitory effects against α-glucosidase with IC50 value of 1.9±0.1 μM, compared to the parent (+)-catechin.
The dihydroxychalcone glucoside phloirdizn was converted by gamma irradiation into three new degradation products, compound(9), compound(10) and compound(11). The new dihydrobenzofuran derivative, compound(9) exhibited significantly improved inhibitory effect against α-glucosidase with IC50 value of 40.1±2.5 μM, compared to the parent phloridzin. Then flavonoid glucoside rutin was exposed at 25 kGy of gamma-ray and produced three new hydroxymethylated products radiorutinol(12), isoradiorutinol(13) and radiorutindiol(14) in the C-ring by gamma-irradiation. The new unusual rutin derivative isoradiorutinol(13) exhibited significantly enhanced inhibitory effect against α-glucosidase with IC50 value of 11.2±0.7 μM, compared to the parent rutin. Radiolytic transformation of the rosmarinic acid with gamma irradiation afforded three new degraded products, rosmarinosin A(15), rosmarinosin B(16) and rosmarinosin C(17), as well as known compound, (S)-orebiusin A(18). The new phenylpropanoid, rosmarinosin B(16), exhibited significantly improved inhibitory effect against tyrosinase with IC50 value of 190.4±1.4 μM. Also, known compound (S)-orebiusin A(18) exhibited significantly improved anti-adipogenic properties against of 3T3-L1 preadipocyres compared the parent rosmarinic acid.
The results of the current study verify that natural polyphenol compounds is transformed into a new modified products, along with known compounds, and the structure of new compounds was elucidated by interpretation of spectroscopic data. The biotransformation of polyphenol compounds by plasma treatment and gamma irradiation may be a valuable and convenient strategy for structural modification and the enhancement of activity. More systematic structure modification will be performed for the further development activity improvement of polyphenol compounds.

국문 초록 (Abstract)

폴리페놀 화합물은 천연물에 광범위하게 존재하고 있으며 특히 식품을 통하여 쉽게 섭취가 가능하며, 야채 및 과일 등에 풍부하게 함유되어 있고, 2차 대사산물로 다양한 구조와 분자량을 가지고 있다. 또한 다양한 생리활성을 보이며 폴리페놀 화합물은 주로 우수한 항산제의 역할을 한다. 폴리페놀 화합물의 구조변환 연구는 지속되어 왔으며, 주로 폴리페놀 산화효소를 활용하여 다양한 폴리페놀 산화생성물이 보고되었고, 또한 다양한 미생물 균을 활용한 구조변환 연구가 보고되었다. 하지만 플라즈마를 활용한 구조변환 연구는 미미한 실정이고, 감마선을 활용한 구조변환 연구는 지속되어 왔으나 화합물의 분리 동정 및 생리활성에 대한 연구는 제한적이다.
본 논문에서는 천연 폴리페놀 화합물인 phloridzin 및 (+)-catechin을 플라즈마 처리와 phloridzin, rutin 및 rosmarinic acid에 감마선 조사를 이용하여 화합물의 구조변환을 확인 하였고, 항 당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase 저해활성, 항비만 활성과 관련된 pancreatic lipase 저해활성 평가를 수행 하였다. 그리고 플라즈마 처리 및 감마선 조사에 의해 구조변환 된 화합물을 역상 HPLC 및 각종 칼럼크로마토그래피를 이용하여 물질을 분리 정제하였고, 분리된 물질은 1H-, 13C-의 1D NMR과 1H-1H COSY, NOESY, HMBC 및 HSQC 등의 2D NMR, UV, [α]D 및 FABMS 스펙트럼 등을 측정하여 화합물의 구조를 결정하였다. 그 결과 phloridzin에 플라즈마 처리를 이용하여 생성된 화합물을 분리하였으며, 신규화합물인 methylenebisphloridzin(1), deglucosylmethylbisphloridzin(2) 및 methylenebisphloretin(3)를 구조 결정 하였고, 기지 화합물인 phloretin(4)을 구조 동정하였다. 분리된 단일물질을 항 당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase 저해활성 평가하였으며, 이 중 phloretin(4)의 이량체인 methylenebisphloretin(3)의 IC50값이 4.2±0.9 μM로 매우 우수한 저해 활성이 나타났고, 또한 항비만 활성과 관련된 pancreatic lipase 저해활성에서도 IC50값이 5.2±0.5 μM의 매우 우수한 저해활성을 보였다. 그리고 지방 세포인 3T3-L1에서 지방세포 분화 억제활성이 100 μM의 농도에서 63.5%로 우수한 억제활성을 확인하였다. (+)-Catechin에 phloridzin에 사용했던 동일한 방법을 이용하여 플라즈마 처리를 한 후 (+)-catechin 이량체인 화합물(5) 및 화합물(6)의 신규화합물을 구조 결정하였고, 기지 화합물인 bis 8, 8'-catechinylmethane(7) 및 bis 6, 8'-catechinylmethane(8)을 구조 동정하였다. 분리된 단일 물질에 대하여 항 당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase 저해활성을 평가한 결과, 신규 화합물(5)에서 IC50값이 1.9±0.1 μM로 매우 우수한 저해활성이 나타났다. 이상의 결과로 플라즈마를 처리한 화합물에서 항 당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase 저해활성이 상승한 것을 확인하였고, 분리 정제된 단일물질에서 α-glucosidase 저해활성이 플라즈마 처리되지 않은 화합물보다 상승한 것을 확인하였다.
감마선 조사를 이용하여 phloridzin의 분해산물을 단일물질로 분리 정제하여 화합물(9), 화합물(10) 및 화합물(11)의 3종의 신규 화합물을 구조 결정하였다. 분리된 단일물질을 항 당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase 저해활성 평가를 수행하였으며, 분리된 단일물질 모두 phloridzin보다 저해활성이 상승한 것을 확인하였고, 그 중 화합물(9)에서 IC50값이 40.1±2.5 μM로 가장 우수한 저해활성이 나타났다. 그리고 rutin을 감마선 조사를 이용하여 분해산물을 단일물질로 분리 정제하였으며, radiorutinol(12), isoradiorutinol(13) 및 radiorutindiol(14) 3종의 신규 화합물을 구조 결정하였다. 분리된 단일물질을 항 당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase 저해활성 평가를 수행하였으며, 그 중 isoradiorutinol(13)의 IC50값이 11.2±0.7 μM로 매우 우수한 α-glucosidase 저해활성이 나타났다. 또한 rosmarinic acid를 감마선 조사를 이용하여 분해산물을 단일물질로 분리 정제하였으며, rosmarinosin A(15), rosmarinosin B(16) 및 rosmarinosin C(17)의 3종의 신규 화합물을 구조 결정하였으며, 기지 화합물인 (S)-oresbiusin A(18)을 구조 동정하였다. 분리된 단일물질을 대상으로 미백 개선과 관련된 tyrosinase 저해활성을 평가하였으며 신규 화합물인 rosmarinosin B(16)에서 IC50값이 190.4±1.4 μM로 우수한 저해활성이 나타났다. 그리고 항비만 활성과 관련된 3T3-L1 지방세포에서 분화 저해활성을 측정한 결과 (S)-oresbiusin A(18)에 5 및 10 μM의 저 농도에서 42.3 및 64.9%의 지방세포 분화 억제활성을 확인하였으며, rosmarinic acid 보다 지방세포 분화 억제활성이 상승한 것을 확인하였다.
이상의 결과로 플라즈마 및 감마선 조사가 폴리페놀 화합물의 구조 변환을 유도하였고 분리 정제된 화합물에서 생리 활성 기능이 상승한 것을 확인하였다. 향후 분리 정제된 신규 화합물을 대상으로 세포 실험 및 동물 실험을 통하여 추가적인 기능성 탐색이 필요하다고 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 이론적 배경 5
• 1. 폴리페놀 화합물 연구 5
• 2. 천연물 관련 플라즈마 처리 기술 연구 동향 6
• 3. 천연물 관련 감마선 조사 기술 연구 동향 8
• Ⅲ. Phloridzin의 플라즈마 처리 10
• 1. 재료 및 방법 10
• 2. 결과 및 고찰 13
• Ⅳ. (+)-Catechin의 플라즈마 처리 44
• 1. 재료 및 방법 44
• 2. 결과 및 고찰 46
• Ⅴ. Phloridzin의 감마선 조사 70
• 1. 재료 및 방법 70
• 2. 결과 및 고찰 72
• Ⅵ. Rutin의 감마선 조사 100
• 1. 재료 및 방법 100
• 2. 결과 및 고찰 102
• Ⅶ. Rosmarinic acid의 감마선 조사 128
• 1. 재료 및 방법 128
• 2. 결과 및 고찰 130
• 참고문헌 161
• 영문초록 165