TBT 만성노출에 따른 대복, Gomphina veneriformis의 생물지표 연구 = Study on the bioindicator of the equilateral venus, Gomphina veneriformis(Bivalvia: Veneridae) chronically exposed to TBT (tributyltin chloride)

국문 초록 (Abstract)

(국문초록)
해양에서 내분비계장애물질에 관한 많은 정보를 획득하기 위하여 다양한 지표생물과 생물학적 지표를 이용한 연구들이 수행되어 왔다. 이 가운데에서도 정착성이며, 오염원의 체내 흡수 및 축적 보다 해독과 체외방출이 낮고, 자극에 대한 행동반응 및 생리반응이 비교적 단기간에 나타나는 이점을 가진 이매패류가 널리 이용되고 있다. 하지만 기존의 많은 연구들은 고농도의 오염원에 대한 단기간의 노출영향 연구가 대부분이며, 이러한 단기간 노출 연구들은 낮은 농도에서 지속적으로 영향을 받는 생물들의 변화를 관찰하는데 한계가 있다.
본 연구는 백합과 이매패류인 대복, Gomphina veneriformis을 OECD test guideline에 준용하여 0, 0.4, 0.6, 0.8 ㎍ TBTCl L-1의 농도에 36주 동안 노출 시킨 후 생물지표들의 영향을 관찰하였다.
본 연구에 이용된 생물지표들은 생리학적 지표와 생화학적 지표, 생식생물학적 지표 그리고 조직학적 지표들이며, 각각의 지표들의 상호 연관관계와 오염원에 의해 사망에 이르게 되는 원인을 규명하고자 하였다.
TBT 노출구에서 저질과 체내의 유기주석화합물은 농도 의존적으로 증가하였다. 생존율은 대조구와 노출구간에 유의적인 차이를 보였으며 (P<0.05), 노출구들의 성장 또한 대조구와 유의적인 차이를 보였다 (P<0.05). 산소소비율은 노출 4주 이후 부터 감소하여 모든 노출구들은 대조구와 유의적인 차이를 보였으며 (P<0.05), 여과율은 노출 4주와 12주에만 대조구와 노출구간에 유의적인 차이를 보였다 (P<0.05). 노출구들의 저질잠입률은 노출 12주 이후부터 감소하기 시작하여 노출 36주에는 모든 노출구들이 대조구와 유의적인 차이를 보였다 (P<0.05).
생화학적 지표로서 체구성물질 가운데 회분은 암컷과 수컷 모두 대조구보다 노출구에서 높은 비율로 나타났으며, 지질은 암컷과 수컷 모두 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구에서 28주에 높게 증가하였지만, 노출 기간이 길어짐에 따라 노출구의 개체들은 대조구 보다 함유 비율이 낮아졌다. 대조구 암컷의 단백질 비율은 증가하였지만, 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구의 암컷은 12주부터 비율의 변화가 없었고, 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구의 수컷은 대조구와 반대로 단백질 비율이 증가 혹은 감소하였다. 수분은 암컷과 수컷 모두 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구의 개체들은 가장 높은 비율을 보였지만 노출 기간이 길어질수록 감소하였다.
생식생물학적 지표 가운데 암컷에 대한 수컷의 성비는 TBTCl 노출구의 개체들은 수컷의 비율이 높았다. 비활성기부터 노출된 개체들은 암컷과 수컷 모두 농도 의존적으로 생식소발달단계가 지연되었다. 암컷의 생식소지수는 0.6와 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구들이 대조구와 유의적인 차이를 보였으며 (P<0.05), 수컷의 경우에는 모든 노출구들이 대조구와 유의적인 차이를 보였다 (P<0.05). 비만도는 암컷과 수컷 모두 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구들이 대조구와 유의적인 차이를 보였다 (P<0.05). 자웅이체인 대복의 암컷과 수컷의 생식소에서 관찰되어진 intersex의 비율 또한 수컷보다는 암컷에서 높게 나타났으며, 농도 의존적으로 증가하였고, 노출 20주 이후부터는 모든 노출구에서 암컷과 수컷 상호간에 유의적인 차이가 나타났다 (P<0.05).
조직학적 지표 가운데 외투막은 노출 12주 이후부터 조직병리학적인 증상이 나타나기 시작하여, 노출기간이 길어짐에 따라 섬모 탈락, 결합조직층 파괴 및 상피층의 파괴가 나타났고, 특히 각피형성층과 인접한 가운데 주름과 바깥쪽 주름의 병변이 심화되었다. 아가미에서는 노출 4주부터 혈구의 증가에 따른 혈림프동의 확장이 관찰되었으며, 노출 기간이 길어짐에 따라 새엽의 섬모가 소실되었고, 미토콘드리아의 막이 파괴되었다. 특히 36주 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구에서는 새엽 상피세포가 파괴되어 키틴질 기둥이 드러나는 조직상이 관찰되었다. 발의 경우에는 노출 12주에 조직병리학적인 증상이 관찰되지 않았지만, 20주 이후부터는 원형질막의 팽창으로 인하여 미세융모와 섬모의 곤봉화 및 섬모의 주변미세소관이 소실되고, 상피세포의 부종이 관찰되었다. TBTCl에 노출된 소화선세관은 노출 초기에 소화선세관 주변에 점액다당류가 증가하였으며, 특히 0.8 ㎍ TBTCl L-1 농도구에서는 소화선세관의 상피세포 핵이 파괴되면서 상피층의 붕괴가 관찰되었다. TBTCl 농도구들에서는 소화선세관에 지방갈색소의 침적이 증가하였는데, 이후 소화선세관의 붕괴로 인하여 체내 TBT의 농도와 지방갈색소의 축적이 감소하였다.
이러한 기관계의 조직병리학적인 증상들은 노출 20주 이후부터 본격적으로 생리학적인 장애를 유발하는 것으로 여겨진다.
본 연구의 결과 TBTCl은 대복의 생존율을 감소시키며, 기관계 변형에 의한 생리적 장애가 나타났다. 특히 유기주석화합물은 생식소 발달을 억제 시키고, 수컷에서 보다 암컷에서 intersex를 더 많이 유발시키며, 수컷의 비율이 증가하는 것으로 보아 성 성숙 장애와 androgenic effector로서의 기능을 하는 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

(Abstract)
Many studies have been undertaken in order to obtain information about endocrine disrupting chemicals (EDCs) in the marine using the various bioindicators. Bivalves have been extensively used, as they are usually sedentary and slow detoxifier, and show quick physiolgical and behavioral responses on the pollutants. However, most previous studies were acute experiments exposed to high concentrations of pollutants, and also they were limited to biological responses on chronical exposure with low concentrations.
The experiments were taken for 36 weeks, commencing on October 25, 2005. Exposure concentrations consisted of 4 TBTCl exposure groups (0, 0.4, 0.6, 0.8 ㎍ L-1). Experimental species used in this study was the equilateral venus, Gomphina veneriformis (SL=30.0-35.0 mm).
Bioindicators used in this study were physiological, biochemical, reproductive and histopathological toxicity effects, The purposes of this study were to identify relationships between bioindicators and causes for mortality by the pollutant.
Butyltins in sediment and soft tissue of G. veneriformis in the TBTCl exposure groups showed a tendency to increase as TBTCl concentration rised. Survival rate and growth were significantly different fromm the control (P<0.05). Oxygen consumption rate decreased after 4 weeks and there were significant differences between the control and exposure groups (P<0.05). Filtration rate of exposure groups was significantly different from the control (P<0.05) at 4 and 12 weeks. Burrowing activity decreased after 12 weeks and there were significant differeces between the control and exposure groups (P<0.05) at 36 weeks.
Ash composition, on of biochemical indicator, in female and male in TBTCl exposure groups as higher than control. Lipid composition of an 0.8 ㎍ TBTCL L-1 group female and male at 28 weeks increased, but it was lower in TBTCl exposure groups than control with an increase of exposure time. Protein composition of control was increased, while after 12 weeks, the female didn't show any changes in 0.8 ㎍ TBTCl L-1 group. Protein composition of male in 0.8 ㎍ TBTCl L-1 group decreased. Moisture composition in female and male in 0.8 ㎍ TBTCl L-1 group as the highest among all the experimental groups, but decreased with an increase of exposure time.
In the reproductive indicator, male ratio of all exposure groups was higher than female. Gonad development in female and male of G. veneriformis exposed to TBTCl illustrated an a tendency to be inhibited as TBTCl concentration increased. GI of female of 0.6 and 0.8 ㎍ TBTCl L-1 groups was significantly different from control (P<0.05) and male in all TBTCl exposure groups. CI of female and male of 0.8 ㎍ TBTCl L-1 group appeared significant different from control (P<0.05). Intersex was higher in female than in male and it illustrated tendency to increase as TBTCl concentrations. Therefore, in all TBTCl exposure groups, there were significant difference between female and male after 20 weeks in intersex (P<0.05).
In the case of histopathological indicator, after 12 weeks, the mantle showed histopathological changes and then disappearance of cilia, destruction of collagen and muscle fiber, and collapse of epidermal layer were observed. Especially, a serous histopathological problem in middle and outer fold near the periostracum was observed. Hemolymph sinus in gill exposed to TBCl was extended with an increase of hemocytes at 4 weeks, and then the cilia and mitochindria membrane disappeared and destructed, respectively. Moreover, in 0.8 ㎍ TBTCl L-1 group at 36 weeks, gills showed filaments that come out chitinous rod from destruction of epithelium. After 20 weeks, in exposure groups, the foot showed swelling at anterior tip of microcilli and cilia by the extension plasmamembrane and edema of epithelia. Digestive gland of G. veneriformis exposed to TBTCl showed an increase of number of hemocyte and mucopolysaccaride near the digestive tubule at early time of the exposure. Especially, in 0.8 ㎍ TBTCl L-1 group, collapse of digestive tubule with modificaton of epithelium was observed. As the concentration of TBTCl increased, the accumulation of lipofucin increased in the digestive gland, but the collapse of digestive tubule induced a decrease of accumulation of butyltins and lipofuscin.
These histopathological changes induced remarkable physiological disorders after 20 weeks.
Results of this study suggest that TBT decrease in survival rate and induce physiological disorders with histopathological changes. Furthermore, TBT could function as a reproductive inhibitor and androgenic effector on an increase of male ratio and higher intersex in male than female of G. veneriformis.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 재료 및 방법 9
• 1. 재료 9
• 2. 방법 10
• 1) 실험조건 10
• 가) 사육수조 10
• 나) 노출기간 10
• 다) 시험물질 11
• 라) 실험구 11
• 마) 수온 11
• 2) 유기주석화합물 분석 13
• 가) 시료 전처리 13
• 나) 분석조건 14
• 다) 정성 및 정량 14
• 라) 검출한계 및 회수율 15
• 3) 생리학적 지표 분석 15
• 가) 생존율 15
• 나) 성장 15
• 다) 산소소비율 16
• 라) 여과율 16
• 마) 저질잠입률 17
• 4) 생화학적 지표 분석 18
• 가) 회분 18
• 나) 지질 19
• 다) 단백질 19
• 라) 수분 20
• 5) 생식생물학적 지표 분석 20
• 가) 성비 21
• 나) 생식소발달단계 21
• 다) 생식소지수 (GI) 21
• 라) 비만도 (CI) 24
• 마) Intersex 24
• 6) 조직학적 지표 분석 24
• 가) 측정 및 해부 24
• 나) 광학현미경적 관찰 25
• 다) 전자현미경적 관찰 27
• 라) 조직학적 변화양상의 정량화 28
• 7) 유의성 검증 28
• III. 결과 29
• 1. 유기화합물 축적 농도 29
• 1) 저질 29
• 2) 생물 29
• 2. 생리학적 지표 37
• 1) 생존율 37
• 2) 성장 38
• 3) 산소소비율 40
• 4) 여과율 41
• 5) 저질잠입률 42
• 3. 생화학적 지표 43
• 1) 회분 43
• 2) 지질 46
• 3) 단백질 49
• 4) 수분 52
• 4. 생식생물학적 지표 55
• 1) 성비 55
• 2) 생식소발달단계 57
• 3) 생식소지수 (GI) 62
• 4) 비만도 (CI) 65
• 5) Intersex 68
• 5. 조직학적 지표 72
• 1) 외투막 72
• 2) 아가미 91
• 3) 발 109
• 4) 소화선 125
• 5) 지방갈색소 144
• IV. 고찰 147
• V. 결론 179
• VI. 참고문헌 180
• Abstract 220