A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis of P19 cells = P19 세포의 신경분화과정에서 마이크로RNA-9의 발현을 색변화로 감지하는 분자 비컨 개발

국문 초록 (Abstract)

분자 비컨 (Molecular beacon, MB) 은 짧은 oligonucleotide 로써 보통은 stem-loop 구조로, 한쪽 끝에는 형광탐침과 다른 한쪽에는 그 형광을 끌 수 있는 quencher 가 달려 있는 형태이다. 이러한 MB 은 세포내에 존재하는 생체 분자를 감지하는데 주로 사용되고, miRNA 의 발현을 감지하는데도 많이 사용된다. 하지만 기존의 MB 은 한 가지 형광탐침만 사용하여 형광의 꺼짐/ 켜짐 시스템을 통하여 miRNA 를 감지하게 되는데, 이 경우 형광의 밝기가 약하게 나타날 때, 이 약한 밝기가 감지하려고 하는 miRNA 의 발현이 적은 것에 기인하는지 아니면 MB 의 transfection 효율이 낮은 것에 기인하는지를 구분하기가 어렵다. 또한 기존의 stem-loop 구조는 구조 변화에 의해 형광이 켜지는 시스템으로 quencher 가 완전히 분리 되지 않아 quencher 의 영향을 다소 받을 수 있다는 단점이 있다.
본 연구에서는 이러한 단점을 극복하기 위해 두 가지 형광 탐침을 이용한 linear 구조로, 색의 변화로써 miRNA 의 발현을 감지할 수 있는 MB 을 개발하였다. target 으로 보고자 하는 miRNA 는 신경분화과정에서 발현이 증가하는 miR-9 으로, P19 세포를 retinoic acid 처리를 하여 신경세포로 분화시켜 그 과정동안의 miR-9 의 발현 양상을 색변화 miR-9 MB (color-tunable miR-9 MB, ColoR9 MB)의 색변화로 관찰하고자 한다.
ColoR9 MB 는 부분적으로 이중가닥을 갖는 oligonucleotide 로써, 긴 가닥에는 miR-9 이 결합할 수 있는 상보적인 sequence 를 가지고 양쪽 말단에는 한 쪽에는 reporter probe 로 Cy3 형광을 달고, 다른 한 쪽에는 referenece probe 로 Cy5.5 형광을 달았다. 그리고 짧은 가닥에는 Cy3 형광을 끌 수 있는 quencher 인 BHQ1 을 달아 긴 가닥과 짧은 가닥의 oligonucleotide 가 부분적으로 수소결합을 이룰 수 있도록 디자인하였다. 두 가닥의 수소결합을 통해 합성된 ColoR9 MB 는 먼저 tube 에서 그 기능을 확인한 후, miR-9 의 negative cell 인 CHO cell 에 exogenous miR-9 와 동시에 이입하여 miR-9 을 감지 할 수 있는지를 확인하였고, 신경 분화를 유도한 P19 cell 에 이입하여서는 endognous miR-9 을 감지할 수 있는지를 확인하였다. 또한 ColoR9 MB 가 이입된 P19 cell 을 마우스에 이식해 in vivo 에서도 miRNA 영상이 가능한지를 확인하였다. miR-9 이 존재 하지 않을 때는 reporter probe 인 Cy3 형광 (연두색)은 quencher 에 의해 꺼져 있어 형광이 나타나지 않고 reference probe 인 Cy5.5 형광 (빨간색)은 quencher 와 충분히 떨어져 있으므로 quencher 의 영향을 받지 않아 항시 켜 있게 되어 세포 안의 ColoR9 MB 의 색은 빨간색으로 나타나게 된다. 그러나 miR-9 이 존재할 때는 miR-9 이 ColoR9 MB 의 상보적인 sequence 에 더 높은 결합력으로 결합하므로 quencher 가 달린 짧은 가닥이 떨어지게 되어 Cy3 형광이 켜지게 되고 Cy5.5 형광은 항상 켜 있으므로 두 색의 혼합색인 노란색으로 색의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 reference probe 인 Cy5.5 가 transfection 효율을 나타내 보여 줄 수 있고 quencher 가 형광탐침으로부터 완벽히 분리 되기 때문에 더 정확하게 색변화를 통해 miR-9 의 발현을 감지할 수 있는 방법이 된다. 이러한 방법은 다른 miRNA 에도 적용이 가능하여 다양한 miRNA 의 발현과 그 기능을 이해하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이라 예상한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Molecular beacon (MB), a synthetic oligonucleotide labeled with a fluorophore at one end and a quencher at the other end, has been used to sense intracellular biomolecules including microRNAs (miRNA, miR) which play critical role in cellular developments and diseases. However, the on/off-tunable miRNA MB is difficult to distinguish a change of miRNA expression in cells when the fluorescence brightness is weak due to low expression of miRNA or low transfection of the miRNA MB. To overcome the limitation, we developed a color-tunable miRNA9 MB (ColoR9 MB) to sense miR-9 expression-dependent color change. The ColoR9 MB was synthesized by a partially double-stranded DNA oligonucleotide containing a miR-9 binding site and a reporter probe with Cy3/black hole quencher 1 (BHQ1) at one end and a reference probe with Cy5.5 at the other end. The ColoR9 MB was transfected into CHO and P19 cells. In the absence of miR-9, the ColoR9 MB visualized with red color because Cy3 (green) reporter probe was quenched by BHQ1 and Cy5.5 (red) reference probe was remained constant. However, in the presence of miR-9 in CHO cells and during neuorgenesis of P19 cells where the expression of endogenous miR-9 was gradually increased, the reporter probe of the ColoR9 MB showed miR-9 expression-dependent green fluorescence recovery and red fluorescence of the reference probe remained invariable. The ColoR9 MB visualized CHO and P19 cells with red color in the absence of miR-9 and yellow color in the presence of miR-9. In vivo imaging demonstrated that the green fluorescence recovery of the reporter probe from the ColoR9 MB was gradually increased during neuronal differentiation of P19 cells while red fluorescence activity of the reference probe remained constant. This is because gradual increase in miR-9 expression during neurogenesis of P19 cells was bound to the miR-9 binding site and resulted in the detachment of the quencher oligonucleotide from the ColoR9 MB and fluorescence recovery. This great color-tunable specificity of the ColoR9 MB to sense miR-9 expression-and neurogenesis-dependent color change will be useful for understanding the expression and function of other miRNAs in vitro and in vivo.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• 1. MicoRNAs 1
• 2. Reporter gene based molecular image of miRNAs 3
• A. Optical image modalities 4
• (1) Fluorescence reporter gene-based miRNAs imaging 5
• (2) Bioluminescence reporter gene-based miRNAs imaging 6
• B. MRI image modality 8
• C. Nuclear Medicine image modality 10
• 3. Molecular beacon image system of miRNAs 12
• 4. Color-tunable molecular beacon of miR-9 14
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 16
• 1. Cell culture 16
• 2. Quantification of expression in miRNA 16
• 3. Confirmation of neuronal differentiation with immuno-fluorescence staining 17
• 4. Design of the ColoR9 MB 18
• 5. Transfection and fluorescence intensity 19
• 6. Stability test of the ColoR9 MB 20
• 7. Confocal microscopy 20
• 8. In vivo fluorescence imaging 21
• Ⅲ. RESULTS 23
• 1. Design and mechanism of the ColoR9 MB 23
• 2. Color-tunable specificity of sensing the miR-9 using the ColoR9 MB 26
• 3. Color-tunable imaging of endogenous miR-9 expression during P19 cells neurogenesis 36
• Ⅳ. DISCUSSION 51
• Ⅴ. CONCLUSION 54
• REFERENCES 55
• ABSTRACT IN KOREAN 65