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        완만동결법을 이용한 생쥐배아의 냉동 시 냉해보호제 Ethylene Glycol의 효용성

        김연주 ( Yon Ju Kim ),김옥경 ( Ok Kyong Kim ),박은아 ( Eun Ah Park ),홍순철 ( Soon Cheol Hong ),유상욱 ( Sang Yook Yu ),김탁 ( Tak Kim ),이정재 ( Jung Jae Lee ),오지현 ( Jee Hyun Oh ),허준용,박용균,김선행 ( Sun Haeng Kim ) 대한산부인과학회 2006 Obstetrics & Gynecology Science Vol.49 No.7

        목적: 포유류의 배아를 냉동하는 과정에서, 냉동 보호제와 냉동 방법은 해동 후 생존률과 그 이후의 배아 발달에 매우 중요한 인자이다. 이 실험에서 첫 번째로 완만 동결법에서 냉동 보호제인 ethylene glycol (EG)이 배아 발달에 어떤 영향을 끼치는지를 알아보고자 하였고, 두 번째로 각각의 배아 발달 시기에서 동결 방법에 따른 배아의 생존율 및 발달율 차이를 알아보고자 하였다. 연구 방법: 5-6주된 ICR생쥐로부터 1세포기 배아를 얻었다. 배아 배양을 위한 기본 배양액으로 0.4% BSA가 함유된 T6배지를 사용하였다. 1세포기, 8세포기, 포배기의 배아는 각각 EG, propylene glycol (PROH), glycerol을 사용하여 완만 동결법으로 냉동 보존하였다. 실험 후반부에서 동일한 냉동 보호제인 EG를 사용하여 완만 동결법과 초자화 동결법의 결과를 비교하였다. 끝으로 각 군별로 포배기 배아의 세포수를 측정하여 포배기의 질을 평가하였다. 결과: EG, PROH와 glycerol사이에 회수율, 생존율에서 유의할 만한 차이점은 발견할 수 없었다. 그러나 해동 후 배아 발달에 있어서는 EG군이 1세포기와 포배기 냉동 보존을 하였을 때 우수한 배아 발달을 보였다(P<0.05). 완만 동결법과 초자화 동결법의 비교에서 회수율은 두 그룹간에 차이를 보이지 않았으나, 초자화 그룹에서 유의하게 높은 생존율을 보여주었다(P<0.05). 해동 후 상실기와 포배기로의 발달에 있어서는 1세포기 냉동 보존시 초자화 동결법에서 좋은 발달율을 보였지만 (P<0.05) 8세포기와 포배기에서는 유의한 차이가 없었다. 포배기 배아의 세포수에 있어서 1세포기에 EG를 이용하여 냉동 보존된 군이 PROH, glycerol군에 비해 많은 것으로 나타났다 (P<0.05). 그러나 두 가지 냉동 방법에 따른 포배기 세포수의 차이는 없었다. 결론: 이상의 결과로 생쥐 배아 냉동시, EG가 지금까지 사용된 냉동 보호제인 PROH나 glycerol보다 우수한 것으로 나타났다. 냉동 방법은, 초자화 동결법이 완만 동결법보다 우수하였다. Objective: We intended to know how the cryoprotectant ethylene glycol (EG) would affect the outcome of the embryo development when used in slow freezing method. And to know if there is any difference in the outcome of frozen-thawed embryos according to freezing methods and the timing. Methods: We used 5-6 weeks old ICR female mice and T6 containing 0.4% BSA for basic culture media. The embryos at the developmental stages of 1-cell, 8-cell and blastocyst were cryopreserved respectively by slow freezing method using EG, propylene glycol (PROH), and glycerol as a cryoprotectant. We also compared the results of slow freezing and vitrification methods with the same cryoprotectant, EG. And finally, we evaluated the quality of blastocysts by counting the cell numbers in each group. Results: The post-thaw embryo development were better in EG group when they were frozen at 1-cell and blastocyst stage (P<0.05). Although there were no differences in the recovery rate, the survival rate in vitrification group was significantly higher (P<0.05). Post-thaw embryo development to morula and blastocyst were better in vitrification group when frozen at 1-cell embryo (P<0.05), not at 8-cell and blastocyst group. The cell counts of blastocyst derived from 1-cell stage frozen EG group were significantly increased than that of PROH-glycerol groups (P<0.05), however, there was no difference between the two freezing methods. Conclusion: These results suggest that EG may be advantageous comparing with the conventional cryoprotectants, PROH and glycerol in slow freezing method for mouse embryo cryopreservation. In terms of freezing method, vitrification is better than slow freezing.

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