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7-Ketocholesterol에 의한 Akt 감소와 혈관평활근세포의 세포자멸사
서교원(Kyo Won Seo),김치대(Chi Dae Kim),이원석(Won Suk Lee) 한국생명과학회 2016 생명과학회지 Vol.26 No.2
혈관평활근세포의 세포자멸사는 죽상경화증을 비롯한 여러 혈관질환에서 일어나며, 죽상판의 불안정화에 중요한 역할을 한다. Oxysterol은 혈관평활근세포의 세포자멸사를 야기하는데, 죽상경화 병변에는 비효소적으로 생성되는 주된 oxysterol인 7-ketocholesterol (7KC)이 대량 존재한다고 알려져 있다. 그러나 7KC에 의한 혈관평활근세포의 세포자멸사에 관하여 밝혀진 자세한 기전은 아직 미흡하다. 본 연구는 7KC가 혈관평활근세포의 세포자멸사를 일으키는 기전을 구명하고자 하였다. Sprague-Dawley계 숫쥐의 대동맥 절편으로부터 배양한 혈관평활근세포에 7KC를 처리하여 혈관평활근세포의 생존력의 변동과 세포자멸사를 각각 methylthiazole tetrazolium bromide 분석법 및 trypan blue 분석법 그리고 유세포 분석법, 면역 형광 측정법, 면역침전법 및 웨스턴블럿 등으로 측정하였다. 7KC는 혈관평활근세포의 생존력을 시간- 및 농도-의존적으로 감소시켰고, 혈관평활근세포내에 지질과산화 최종산물인 4-hydroxynonenal (HNE) 생성을 증가시켰으며, HNE 단독 처리 또한 혈관평활근세포의 생존력을 농도-의존적으로 감소시켰다. 7KC 또는 HNE에 의하여 감소되었던 혈관평활근세포의 생존력은 HNE 생성 억제제인 2,4-dinitrophenyl hydrazine 전처치에 의하여 회복되었다. 더욱이 세포생존 매개인자로 잘 알려져 있는 Akt의 발현이 7KC와 HNE에 의하여 농도-의존적으로 감소되었고, 2,4-dinitrophenyl hydrazine 또는 N-acetylcysteine 전처치에 의하여 회복되었다. 단백질분해효소복합체 억제제인 lactacystin은 7KC에 의한 세포자멸사와 Akt 감소는 억제하였지만 7KC에 의한 HNE 생성은 억제하지 못하였다. HNE에 결합된 Akt의 양은 7KC와 HNE에 의하여 현저히 증가하였으며 단백질분해효소복합체 억제제인 lactacystin 전처치 시에도 유의하게 증가하였다. 이상의 결과로 보아 죽상경화 병변에서 7KC는 혈관평활근세포내 HNE 생성을 증가시키고, 이 HNE에 결합된 Akt는 단백질분해효소복합체에 의하여 분해되는 것으로 보이며, 이와 같은 기전에 의하여 죽상판의 불안정화가 촉진되는 것으로 생각된다. Vascular smooth muscle cell (VSMC) apoptosis has been identified in various vascular diseases, including atherosclerosis and restenosis after angioplasty, and has been known to precipitate atherosclerotic plaque instability and rupture. Oxysterols are known as inducers of apoptosis in VSMC, and 7-ketocholesterol (7KC) is the major nonenzymically formed oxysterol in atherosclerotic lesions. The precise mechanism underlying VSMC apoptosis is still poorly understood. In this study, we investigated whether 7KC causes apoptosis, and characterized its apoptotic mechanisms in primary cultured rat aortic VSMC. Cell viability was assessed by MTT assay and trypan blue assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry, immunofluorescence, immunoprecipitation, and Western blot analyses. 7KC markedly decreased the VSMC viability in a time- and concentration-dependent manner, and increased the production of 4-hydroxynonenal (HNE), a major end-product of lipid peroxidation, which also decreased the VSMC viability. Pretreatment with 2,4-dinitrophenylhydrazine, a well-known reagent of lipid peroxidation-derived aldehydes, significantly restored the 7KC-decreased viability of VSMC. Furthermore, HNE, as well as 7KC, reduced the level of total Akt, a major mediator of cell survival. The 7KC-decreased level of total Akt was significantly restored by pretreatments with 2,4-dinitrophenylhydrazine and N-acetylcysteine. Lactacystin, a proteasome inhibitor, protected VSMC against apoptosis and Akt degradation, but did not inhibit HNE production. In the immunoprecipitation assay, 7KC increased HNE-modified Akt. From the results, it seems that, in atherosclerotic lesions, 7KC induces HNE production in VSMC, and this HNE binds to Akt, proceeding to proteasomal degradation of Akt, through which mechanism the atherosclerotic plaque instability may be facilitated.
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