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Characterization of Seed Traits of 13 kDa Prolamin Gene-Edited Rice Lines Generated by CRISPR/Cas9
PHAM HUE ANH 전남대학교 2024 국내박사
Rice seed storage protein is a key nutrient component, providing essential amino acids crucial for human nutrition and a nitrogen source for developing plant seedlings. Prolamin, accounting for 20-30% of the total seed storage proteins, accumulates in ER-derived protein bodies (PB-I). Prolamins are categorized into three groups by molecular size (10, 13, or 16 kDa), while the 13 kDa prolamins are assigned to four subgroups (Pro13a-I, Pro13a-II, Pro13b-I, and Pro13b-II) based on cysteine residue content. Here, we generated four knockout strains of rice using CRISPR-Cas9, named 1a-8-1, 2a-2-1, 4b-9-7, and 8b-3-9, each of which demonstrated selectively reduced expression of specific subgroups of the 13 kDa prolamins (Pro13a-I, Pro13a- I, Pro13b-I/II, and Pro13b-I, respectively). These four mutant rice lines also showed the compensatory expression of glutelins and non-targeted prolamins and were accompanied by low grain weight, altered starch content, and atypically-shaped starch granules and protein bodies. Transcriptome analysis identified 927 transcripts that were differentially expressed in the mutant rice lines during development. Subsequently, a Pearson correlation analysis was conducted among 927 DEGs and 13 kDa prolamin genes, revealing 746 transcripts with a correlation coefficient of ≥|0.7|. A correlation network was established, involving transcripts mainly associated with RNA processing, RNA transcription, protein synthesis, protein folding, protein degradation, protein targeting, protein posttranslational modification, stress response, and transport functions. Analysis of this network revealed a negative correlation between genes in the Pro13a-I subgroup and those in the Pro13a-II and Pro13b-I/II subgroups. Moreover, the alterations in the transcription levels of 9 ER stress and 17 transcription factor genes was also observed in mutant rice in which expression of 13 kDa prolamin genes was suppressed. Our results provide valuable insight into the regulatory mechanisms underlying rice seed development and the specific roles played by 13 kDa rice prolamins and their target genes. 프롤라민 (Prolamin)은 인간의 중요 영양소인 필수 아미노산 공급원과 종자 발아를 위한 질소원으로 이용되는 벼 종자 저장단백질의 20~30%를 차지하는 단백질로 세포내 소포체 (Endoplasmic Reticulum)로 부터 유래된 단백질체 (Protein Body-I) 소기관에 축적되어 있다. 프롤라민은 분자량에 따라 3개 그룹 (10, 13, 16 kDa)으로 나누어 지고, 13 kDa 프롤라민의 경우 아미노산 서열 상동성과 cysteine 아미노산 수에 따라 4개 서브그룹 (Pro13a-I, Pro13a-II, Pro13b-I, Pro13b-II)으로 구분된다. 본 연구에서 CRISPR-Cas9 시스템을 활용하여 13 kDa 프롤라민의 특정 서브그룹 (Pro13a-I, Pro13b-I, Pro13b-I/II)의 함량을 선택적으로 감소시킨 프롤라민 유전자 knockout (KO) 벼 4 계통 (1a-8-1, 2a-2-1, 4b-9-7, 8b-3-9)을 생산하였다. 프롤라민 유전자 KO 벼 4계통에서 글루텔린과 비표적 프롤라민 유전자의 보상적 발현 증가, 곡물 중량 저감, 전분 함량 변화 및 전분 과립과 단백질체 모양의 비정형이 관찰되었다. 전사체 분석을 통해 종자 발달 과정에서 프롤라민 KO벼 4 계통에서 전체 927개의 DEG (Differentially Expressed Gene)가 확인되었고, DEG와 13 kDa 프롤라민 유전자 사이의 Pearson 상관 분석을 수행하여 상관 계수가 ≥|0.7|인 746개의 유전자를 밝혀냈다. 이들 중 RNA 처리과정/전사, 단백질 합성/folding/분해/표적화/번역 후 변형, 스트레스 반응 및 수송에 관여하는 유전자들과 프롤라민 유전자들과의 correlation network 분석 결과 Pro13a-I 하위 그룹의 프롤라민 유전자들과 Pro13a-II 및 Pro13b-I/II 하위 그룹의 유전자들 사이에 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 또한 13 kDa 프롤라민 유전자 KO 벼 종자에서 ER 스트레스 관련 유전자 9개 와 전사조절인자 유전자17개에서 발현 변화가 관찰되었다. 이러한 결과는 벼 종자 발달 조절 메커니즘의 기초와 13 kDa 프롤라민 표적 유전자가 수행하는 특정 역할에 대한 귀중한 정보로 활용될 수 있을 것이다.
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배유특이 promoters를 이용한 serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase 유전자 발현 형질전환 벼
Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase(SHT)는 cinnamoyl CoA-유도체와 serotonin을 기질로 하여 항산화 물질인 4-coumaroylserotonin, feruloylserotoin 등과 같은 serotonin 유도체의 생합성을 촉매 하는 효소이다. 기존 육성한 ubiquitin promoter를 이용한 형질전환 벼 보다 더 많은 량의 serotonin 유도체를 종자에 축적시키기 위해 벼 배유특이 promoters인 glutelin과 prolamin promoter를 이용하여 SHT유전자가 벼 종자에만 발현 하도록 형질전환체를 생산하였다. Southern, Northern, Western blot 등 몇몇의 분자 생물학적인 실험들을 통하여 배유특이 promoters인 glutelinA3와 prolamin promoters를 이용하였을 때 SHT 유전자가 종자에서 어느 정도 발현하는 것을 확인하였지만 이러한 발현이 종자 내로의 serotonin유도체 축적에는 큰 영향을 주지 못함을 확인하였다. 벼 종자의 serotonin 유도체의 함량을 분석하던 중 우리는 HPLC chromatogram에서 16분대에 wild type에서는 아주 미약한 peak가 형질전환 벼에서는 보다 높게 나타남을 확인하였다. 이 시간대에 상응하는 standard가 없었기 때문에 이 peak의 area만을 확인해 본 결과 형질 전환 벼에서 적게는 3배에서 많게는 7배 정도 wilde type보다 높음을 확인하였다. 이는 알지 못하지만 종자에만 존재하는 어떠한 기질이 형질전환 벼에서 발현 되어진 SHT에 의해 미지의 serotonin 유도체를 생산해 냈을 것으로 추정된다. 배유특이 promoters의 이용은 ubiquitin이나 35S promoter를 이용 시 serotonin 유도체 화합물이 식물체의 전반적인 조직에 과다 발현, 축적될 경우 식물의 생육을 저해할 수 있는 상황으로부터 보호하고 이러한 물질이 배유특이 promoter를 사용함으로서 종자 배유부위에만 발현케 하여 주식으로 사용하는 백미에 영양약리물질을 높은 농도로 함유하는 종자 생산을 가능하게 할 것이다.
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품종 및 질소 시비량이 벼 종실의 단백질 함량과 조성에 미치는 영향
Rice proteins are nutritional, hypoallergenic, and healthy for human consumption. Protein is one of the most important factors affecting eating and processing qualities of rice. Therefore, we examined effects of cultivar and amount of nitrogen (N) fertilizer on the content and composition of proteins in rice grains. Rice cultivars used in this study were cvs. Hopumbyeo, Baekok-chalbyeo, Baeksul-chalbyeo, Bosuk-chalbyeo, Dongjin-chalbyeo, Haepyung-chalbyeo, Hwasun-chalbyeo, Jinbu-chalbyeo, and Sangjoo-chalbyeo. The amounts of N fertilizer applied were 0, 7, 9, and 13 kg/10a. There was a considerable variation in crude protein contents, ranging from 6.6 to 9.7% and 5.7 to 8.5%, respectively, in brown and milled rice of the nine test cultivars. There was also a significant varietal variation in content of the four protein fractions. The mean contents of albumin, globulin, prolamin, and glutelin fractions of brown rice were 1.79, 0.48, 0.05, and 6.94%, respectively. Those of milled rice were 0.51, 0.31, 0.1, and 8.07%, respectively. Prolamin content was 1.4~2.5 times higher in waxy-rice than in non-waxy rice cultivars. Albumin, globulin, prolamin, and glutelin fractions for brown and milled rice were composed of seven, five, one, and five major bands, respectively, and no cultivar- or tissue-specific variations were apparent in the fractional profiles. With the increased N levels, content of crude protein was gradually increased with concomitant increase in all protein fractions. The ratios of protein fractions were similar in brown and milled rice at all N fertilizer levels. Little differences were observed in the number of major protein bands between brown and milled rice at any N level. These results suggest that N fertilizer causes quantitative but not qualitative changes in major fractions of rice proteins. Increase in the crude protein content and glutelin fraction with increased N fertilization could be beneficial for human nutrition but detrimental for general eating quality of rice.
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