스테비아(Stevia rebaudiana Bertoni) 육성계통의 유전적 및 형태적 다양성 분석

오용석 세종대학교 대학원 2023 국내석사

스테비아(Stevia rebaudiana Bertoni)는 국화과 다년생 초본으로 원산지는 남미 브라질과 파라과이 국경지대에 인접한 고산지대로 칼로리가 거의 없고 단맛이 강하여 감미료로써 최근 그 중요성이 대두되고 있는 작물이다. 스테비아는 체세포형 자가불화합성(sporophytic self-incompatibility)을 가지고 있어 타가수정을 하며, 발아율이 낮아 대부분 집단육종을 통해 우수한 개체를 선발하여 영양번식으로 계통을 유지한다. 따라서, 우수한 개체를 선발하기 위한 유전적 및 표현형 특성의 다양성을 확인하는 것이 중요하다. 이에 본 논문에서는 국내외에서 수집한 스테비아 유전자원과 육종계통집단을 비교평가하기 위해 발아율, 유전적 및 형태적 특성의 다양성을 분석하였다. 발아율에 관한 실험으로는 스테비아 종자의 계통, 종피색, 발아환경[배양실(25℃±1, 명/암: 16/8), 온실 환경(18~42℃, 자연 광주기)]에 따른 발아율 실험을 진행하였다. 계통별 발아율은 ‘다정’, SV2, SV7-4, SV9-4, SV30-3이 각각 10~12%, 18~20%, 52~60%, 64~66%, 30~32%로 나타났다. 종피색에 따른 발아율은 검은색 종피 종자는 11~85%, 갈색종피 종자는 0~2%의 발아율을 나타내었고 환경에 의한 발아율은 SV7-4만이 56%에서 85%로 상승하여 유의미한 차이를 나타내었다. 유연관계 분석에 관한 실험으로는 수집한 국내외 6개의 유전자원(대비종: ‘수원 11호’, ‘다정’, ‘다감’, ‘중국 유전자원’, ‘이스라엘 유전자원’, ‘브라질 유전자원’)과 56개 육종 계통의 유연관계 분석을 평가하기 위하여 16개의 EST-SSR primer sets (Expressed Sequence Tag - Simple Sequence Repeat)와1개의 RNAseq-SSR primer set (RNA Sequencing based Simple Sequence Repeat)를 사용하였다. 유전적 유사도는 55~85%로 대비종과 육성계통의 대부분을 구별할 수 있었다. 표현형적 특성을 평가하기 위해 식물체 항목에서 3가지(생장모양, 높이, 1차분지 수), 줄기에서 4가지(굵기, 안토시아닌 유무, 마디의 수, 털의 밀도), 잎에서 5가지(모양, 크기, 두께, 녹색의 정도, 결각의 정도)를 측정하여 계통수를 작성한 결과 유사도는 55~95%로 나타났다. 표현형의 피어슨 상관 관계 분석 결과 양과 음의 상관관계가 모두 발견되었다. 생장모양은 줄기의 두께는 -0.19, 결각은 -0.21의 음의 상관관계를 나타내었다. 가장 많은 상관관계를 나타낸 초장(Plant height)은 마디 수는 0.49, 분지 수는 0.44, 줄기의 두께는 0.35, 당도와 0.26, 줄기의 털밀도는 0.25, 결각은 0.20, 개화기와는 -0.20의 상관관계를 나타내었다. 분지 수는 줄기의 두께는 0.40, 마디 수는 0.32, 잎의 모양은 -0.17, 개화기와는 -0.22의 상관관계를 나타내었다. 줄기의 두께는 결각은 0.26, 개화기와는 -0.19의 상관관계를 나타내었다. 안토시아닌의 발현여부는 잎의 두께와 0.22의 상관관계를 나타내었으며 잎의 크기는 잎의 녹색강도와 0.30의 상관관계를 나타내었다. 잎의 모양은 잎의 크기는 0.28, 잎의 녹색강도는 0.28의 상관관계를 나타내었다. 또한 재배방법 차이가 형태적(표현형) 특성에 미치는 영향을 확인하기 위해 유전자원(대비종: ‘다정’, ‘이스라엘 유전자원’, ‘브라질 유전자원’)과 육종 계통을 포트와 노지포장에서 재배하여 특성조사를 진행하였다. 실험 결과 줄기의 두께, 마디의 수, 잎의 두께, 잎의 녹색 강도, 잎의 결각, 개화기에서 유의미한 차이를 나타내었다. 14개의 형태적 특성과 17개의 SSR primer sets간의 연관성을 찾기 위해 Mantel 테스트를 진행하였으나 특별한 상관관계를 찾아내지 못하였다. 본 연구는 향후 스테비아 육종을 위한 유전적 및 형태적 다양성 분석을 통하여 효율적인 육성계통을 선발하기 위한 실험이었으며, 연구결과는 스테비아 육종의 세대 진전에 따른 유전적 및 형태적 특성을 이해하는데 유용한 정보를 제공하여 향후 스테비아 육종에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.

조직배양 기술을 이용한 무병주 대량증식법 개발

강태연 세종대학교 대학원 2024 국내석사

조직배양 기술을 이용한 고구마(Ipomoea Batatas)의 무병주 대량증식법 개발 세종대학교 대학원 바이오산업자원공학과 강태연 고구마(Ipomoea batatas)는 메꽃과(Convolvulaceae)에 속하는 뿌리작물 로, 전세계적으로 재배되며 높은 영양학적 가치를 가지고 있다. 하지만, 고구마는 자가불화합성을 나타내는 영양번식 작물로, 줄기를 삽목하는 자가번식 과정에서 모주가 바이러스에 감염된 경우에는 수량감소와 품질저하가 일어날 수 있는 문제가 발생할 수 있다. 또한 고구마는 건물중량의 약 70%가 전분으로 이루어져 에탄올을 생산하는 원료작물로, 바이오에탄올 생산에 최적의 작물이다. 따라서 최근 연구에서 고구마의 형질전환을 통한 고에탄올 함유 품종 개발이 이루어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 육종한 고구마 품종인 ‘신율미’와 ‘풍원미’의 생장점 배양을 통한 무병묘를 생산한 후 기내 대량증식을 위해 마디배양을 통한 대량증식 조건을 규명하고 고구마의 internode와 잎을 통한 Direct Organogenesis 조건을 확립함으로써 기존보다 빠른 기내배양 식물체를 대량 증식하는 것과 고구마의 형질전환을 위한 기초연구를 진행하고자 하는 것을 목표로 하였다. 첫 번째로, 마디 배양을 통한 고구마의 대량 증식 조건을 규명하기 위해 다양한 종류와 농도의 사이토키닌(BAP, TDZ, Kinetin, Zeatin)을 단독으로 첨가하여 호르몬 배지를 만들고, ‘신율미’와 ‘풍원미’의 마디를 치상하여 배양을 진행하였다. 단독 사이토키닌 실험 결과, ‘신율미’는 Zeatin 0.5mg/L를 첨가하였을 때 생육이 가장 양호하였고 ‘풍원미’는 Kinetin 0.5mg/L, 1mg/L를 첨가하였을 때 생육이 가장 양호하였으며, 두 품종 모두에서 공통적으로 BAP를 첨가한 배지에서 multi- shoot이 발생하였다. 하지만 multi-shoot이 발생할 경우 생장이 저하된다는 점이 확인되었으며 복합 사이토키닌 실험에서는 배양 4주차에 multi-shoot이 발생할 경우 분리배양을 통해 생장의 활성을 유도하였다. 두 번째로, 두 가지 이상의 복합 사이토키닌 호르몬을 조합하여 마디배양을 한 결과 ‘신율미’는 호르몬 배지 3mg/L BAP + 1mg/L Kin 호르몬 조합에서 대량 증식의 중요한 요소인 Multi-shoot의 수(2.8개), shoot 길이(126.0mm), 마디 수(23.6개), 마디 길이(5.2mm)가 가장 양호하게 나타났다. 예외적으로 1mg/L BAP + 0.05mg/L TDZ + 0.3mg/L Zeatin 호르몬 조합에서 shoot 길이(190.3mm)가 비약적으로 높게 나타났으나, 형태적인 특징에서 변이가 관측되었으므로 대량 증식에 있어 적합하지 않은 것으로 판단되었다. ‘풍원미’ 품종은 1mg/L BAP + 0.5mg/L Kin 호르몬 조합에서 대량 증식의 중요한 요소인 Multi- shoot의 수(1.8개), shoot 길이(213.0mm), 마디 수(22.1개), 마디 길이(10.0mm)가 가장 양호하게 나타났다. 마지막으로, 1mg/L NAA가 포함된 다양한 농도의 질산은(AgNO3)과 다양한 농도의 TDZ, BAP를 이용하여 Direct Organogenesis를 위한 최적 조건을 찾고자 하였다. 실험 결과, 비록 질산은과 TDZ, BAP처리구 모두에서 부정아는 형성되지 않았으나, 질산은 처리시 뿌리가 형성되었다. 반면에 TDZ과 BAP 처리시 Direct Organogenesis가 일어나지 않고 Callus만 활발하게 형성되었다. 이를 통해 Direct Organogenesis를 위한 다른 호르몬 처리 실험을 시도해 봐야 할 것이며, Callus 생성은 잘 되었으므로 Callus 유도 및 재분화를 통한 고구마 재분화 체계 확립도 시도해 볼 수 있을 것으로 예상되었다. 본 연구의 결과를 통해 확립된 대량증식 최적 조건이 고구마 기내 대량 증식 과정에 활용한다면, 고품질의 무병묘 고구마 대량 증식과 품종 유지에 도움이 될 것으로 생각된다. 주요어: 고구마(Ipomoea Batatas), 마디 배양, 생장점 배양, 사이토키닌, Multiplication, Direct Organogenesis

Study of the Molecular Mechanism for HIPP24 which is involved in arsenite tolerance in Arabidopsis thaliana : 애기장대에서 3가비소 저항성에 관여하는 HIPP24의 분자기전에 대한 연구

LE HOANG KHAN SEJONG UNIVERSITY - Department of Bioresources Eng 2023 국내석사

Arsenic (As) is a toxic pollutant that mainly enters the human body via plants. Therefore, understanding the strategy for reducing plant arsenic accumulation is essential to human health and the environment (Modareszadeh et al., 2021). However, plants have evolved several strategies to improve their heavy metal tolerance. Heavy metal-associated proteins (HMPs) participate in heavy metal detoxification (Li et al., 2020). Our previous lab research demonstrated that overexpression of AtHIPP24 in Arabidopsis leads to increased tolerance to As(III) by reducing ROS levels in the root (data have not been published). However, the underlying molecular mechanism of AtHIPP24's role in arsenic tolerance remains poorly understood. To gain insights into the molecular mechanism of AtHIPP24, we generated deletion constructs of the protein and expressed them in both yeast and plants. In Saccharomyces cerevisiae, yeast strain ATCC 4001531 expressed AtHIPP24 showed higher tolerance than the expressing vector yeast strain. Yeast lines express AtHIPP24-deletion constructs exhibited a lower As(III) tolerance rate. Specifically, AtHIPP24-3D, lacking amino acid number 40 in the heavy metal-associated (HMA) domain, yeast line showed the highest sensitivity with As(III). In Arabidopsis thaliana, our investigation of AtHIPP24 and its deletion constructs revealed essential insights into their roles in As(III) tolerance. Among the tested constructs, AtHIPP24-3D, lacking amino acid number 40 in the heavy metal-associated (HMA) domain, demonstrated the lowest tolerance rate, emphasizing the critical role of this specific amino acid in enhancing As(III) tolerance. In addition, the AtHIPP24-5D construct, lacking the isoprenylation motif, exhibited decreased sensitivity to As(III) compared to AtHIPP24-3D. However, As(III) tolerance rate remained lower than other constructs, indicating the significance of the isoprenylation motif in the As(III) tolerance ability of AtHIPP24. These findings collectively suggest that both the heavy metal-associated domain; the isoprenylation motif contribute to the As(III) tolerance capacity of AtHIPP24 in Arabidopsis thaliana. CRISPR/Cas9 technology to create athipp24 knock-out plants has provided compelling evidence for the involvement of AtHIPP24 in arsenite tolerance in Arabidopsis thaliana. The knock-out plants displayed significant sensitivity to Arsenite, indicating that AtHIPP24 plays a crucial role in the plant's ability to withstand arsenite-induced stress. We found that both AtHIPP24-3D transgenic plants and athipp24 knock-out plants exhibited similar tolerance rates, which were lower than those of the wild-type plants. This suggests that amino acid number 40 within the HMA domain facilitates arsenite binding with the HIPP24 protein. Keywords: AtHIPP24, CRISPR/Cas9, Arsenite, the heavy metal-associated domain, the isoprenylation motif.

두 종의 고 리놀레산 돌연변이 들깨에서 FAD3 유전자 분석

최현아 세종대학교 대학원 2023 국내석사

들깨 (Perilla frutescens)는 아시아의 전통적인 유지 작물 중 하나이며, 현재 재배종 들깨는 4배체 식물이다. 들깨 종자의 오일은 염증 및 콜레스테롤 감소, 치매와 성인병 예방 등의 효과가 밝혀져 건강기능성 식품 중 하나로 자리매김하고 있다. 이러한 효능은 들깨 종자에 함유된 풍부한 알파 리놀렌산(18:3)에서 비롯된다. 들깨 종자의 지방산 조성은 알파 리놀렌산이 54~64%, 리놀레산(18:2)이 11~16%, 올레산(18:1)이 약 14%, 그 외 포화지방산(16:0, 18:0)으로 이루어진다. 이 때, 효소 FATTY ACID DESATURASE 3 (FAD3)가 소포체에서 18:2 지방산에서 18:3 지방산을 합성하는데 역할을 한다. 들깨는 2쌍의 FAD3 유전자 PfrFAD3a와 PfrFAD3b가 존재하는데, 현재까지 각각의 유전자를 분리하여 기능에 대해 분석한 연구는 없다. 본 연구에서는 감마선 처리로 얻은 고 리놀레산 돌연변이 들깨 두 종 ’SJDY-1-19’와 ‘SJNC-110-18’을 통해 돌연변이 원인 유전자로 두 쌍의 FAD3 유전자들을 분리하여 분석하였다. 야생형 들깨와 비교했을 때, 27% 이상 리놀레산이 증가한 SJDY-1-19는 PfrFAD3b의 4bp 염기 결실과 발달 종자와 잎에서 PfrFAD3b의 전사체가 정상적으로 발현하지 않는 것을 통해 지방산 조성 변화의 원인이 PfrFAD3b의 돌연변이임을 밝혔다. 다음으로 15% 이상 리놀레산이 증가한 SJNC-110-18은 PfrFAD3a와 PfrFAD3b를 특정하는 PCR에서 야생형 들깨와 달리 PfrFAD3a가 증폭되지 않고, PfrFAD3a가 들깨 조직에서 발현하지 않는 것을 통해 지방산 조성 변화의 원인이 PfrFAD3a 유전자의 돌연변이임을 밝혔다. 추가로 PfrFAD3a와 PfrFAD3b 모두 FAD3로써 기능함을 조사하기 위해 종자 특이 발현 프로모터와 과발현 유도 프로모터를 사용하여 애기장대 fad3-2 돌연변이체에 형질전환을 하였다. fad3-2 종자의 18:3 지방산과 비교하여, 형질전환체 종자에서 모두 18:3 지방산이 증진됨을 보여주었다. 이를 통해 PfrFAD3a와 PfrFAD3b가 모두 18:3 지방산 합성 역할을 함을 증명하였다. 본 연구에서 들깨의 FAD3 두 쌍의 유전자 기능을 밝힌 것, 나아가 고 리놀레산 돌연변이 계통 선발과 이들을 구별할 수 있는 분자마커 개발은 다양한 들깨 품종 육성의 기반이 될 것으로 기대된다.

무( Raphanus sativus L.) 육종 계통의 종자 순도검정을 위한 S haplotype specific marker 개발과 SSR marker 탐색

허성호 세종대학교 일반대학원 2023 국내석사

무 F1 3품종 ‘8105(RS-1, S1 x RS-3, S10)’, ‘탑동(RS-1, S1 x RS-2, S10)’,'CW2002(RS-3, S10 x RS-4, S4)’의 양친 4계통을 대상으로 S1(Lim), S4(Lim), S10(Lim) S haplotype을 특이적으로 증폭하는 S haplotype specific marker를 개발하고 계통 특이적 밴드 크기를 나타내는 SSR marker를 탐색하여 무 종자 순도검정에 이용하고자 하였다. 첫 번째로, S haplotype specific marker 개발을 위해 총 9개 S haplotype[S1(Lim), S4(Lim), S5(Lim), S8(Lim), S10(Lim), S16(Lim),S18(Lim), S21(Lim), S26(Lim)]을 동형으로 가지는 것으로 추정되는 무 F1 품종 ‘8105’, ‘탑동’, ‘CW2002’의 양친 4 계통을 포함하는 22개 무 S 동형접합자 계통을 대상으로 실험하였다. 기존에 개발된 S haplotype specific marker 9종과 Class I SRK, SLG 공통 프라이머 세트 10종, Class II SRK, SLG 공통 프라이머 세트 4종을 이용하여 각 육종 계통이 가지고 있는 S haplotype의 SRK와SLG 유전자를 증폭하였다. 이후 sequencing 및 BLAST검색을 통해 기존에 NCBI database에 등록된 다른 S haplotype과 비교하였고 22개 무 S 동형접합자 계통 모두 9개의 S haplotype[S1(Lim), S4(Lim), S5(Lim), S8(Lim), S10(Lim),S16(Lim), S18(Lim), S21(Lim), S26(Lim)]을 동형으로 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이후 S1(Lim), S4(Lim), S10(Lim) S haplotype을 동정하기 위한 specific marker 제작을 위해 Class I, II SRK, SLG 공통 프라이머 세트를 사용하여 증폭한 후 sequencing하여 얻은 SRK kinase domain과 SLG 서열을 NCBI database에 등록된 다른 S haplotype의 SRK kinase domain과 SLG 서열을 Class I, II 별로 Multiple Sequence Alignment (MSA)하여 다형성을 나타내는 영역을 탐색하였다. Class I, II SRK kinase domain과 SLG 염기서열을 대상으로 MSA 분석한 결과를 토대로, SNP 및 InDel과 같은 염기서열 다형성을 나타내는 영역을 대상으로 S1(Lim), S4(Lim), S10(Lim)의 SRK kinase domian과 SLG 유전자에만 특이적으로 결합할 수 있는 S haplotype specific marker를 개발하였다. 또한, 9개의 S haplotype을 대상으로 증폭하여 특이적으로 결합하는지 확인하였다. 실험결과, 개발한 SRK1-KD(Lim) 5개 프라이머 세트, SLG1(Lim) 1개 프라이머 세트와 SLG4(Lim) 1개 프라이머 세트 그리고 SRK10-KD(Lim) 1개 프라이머 세트, SLG10(Lim) 5개 프라이머 세트를 사용했을 때 모두 S1(Lim), S4(Lim), S10(Lim) S haplotype 에서만 특이적으로 증폭되었으며, in silico상으로 예측한 밴드 크기와도 일치하였다. 두번째로, 무 F1 품종 ‘8105’, ‘탑동’, ‘CW2002’의 양친 4계통과 무 육종 소재로 높은 가치를 가지는 7개 육종 계통을 포함하는 총 11개 무 육종 계통을 식별할 수 있는 SSR marker를 탐색하였다. 기존에 개발된 EST-SSR marker 55개와 genomic SSR marker 5개 중 PIC값이 가장 높은 EST-SSR marker 23개와 genomic SSR marker 3개로 구성된 SSR marker 26개를 선발하여 3회의 screening을 진행하였다. 1번째 screening 시 F1 품종 ‘8105’, ‘탑동’, ‘CW2002’ 4개 양친 계통 간 비교했을 때 SSR marker 20개에서 다형성을 탐색하였다. 이후 SSR marker 20개를 사용하여 2번째 screening을 진행했을 때, ‘8105’ 모계에서만 계통 특이적 밴드 크기를 나타내는 SSR marker 7개, ‘CW2002’ 부계에서만 계통 특이적 밴드 크기를 나타내는 SSR marker 2개를 탐색하였다. 마지막으로 3차 screening을 통해 ‘8105’, ‘탑동’, ‘CW2002’에 사용되는 양친 4계통에서 계통 특이적 밴드 크기를 나타내는 SSR marker를 찾고자 하였으나, ‘8105’ 모계의 ‘RSS0881’ SSR marker를 제외하고 나머지 3계통에서 계통 특이적 밴드 크기를 나타내는 SSR marker를 찾을 수 없었다. 이는 무 육종 계통의 수와 종류에 따라 길이 다형성을 나타내는 SSR marker 종류가 다를 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서 1개 또는 적은 수의 SSR marker만 사용할 경우 혼입된 다른 계통 식별이 어려울 수 있기에 사용하는 무 육종 계통 집단을 대상으로 SSR screening 이후 최소 3개 이상의 SSR marker를 선발해서 사용해야 정확한 계통 분류, 순도검정이 가능할 것으로 판단되었다. 본 논문에서 개발한 S1(Lim), S4(Lim), S10(Lim) S haplotype specific marker와 SSR marker는 무 육종계통의 S haplotype 분석 및 종자 순도검정용으로 유용할 것으로 기대된다.

A Core SNP Marker Set for Genomic Selection of Bacterial Wilt Resistance in Tomato

연제윤 세종대학교 대학원 2023 국내석사

Bacterial wilt (BW) caused by Ralstonia solanacearum is a devastating disease of tomato resulting in severe production loss. Host resistance against this soil-borne pathogen provides a cost-effective and environment-friendly strategy to control this disease. Genomic selection (GS) is a promising breeding method for improving complex traits controlled by numerous genes with minor effects. This study aimed to optimize the GS model and develop a core SNP marker set for improving BW resistance using two tomato germplasm collections, TGC1 (n=162) and TGC2 (n=192) which have different genetic backgrounds. Disease severity was evaluated in three independent seedling assays following inoculation with race 1 of Ralstonia solanacearum in each collection. In addition, the resulting phenotypic data were corrected using the best linear unbiased prediction (BLUP). The 51K AxiomTM SNP array was used for genotyping, resulting in 31,330 confident SNPs as a common set for both populations. With these phenotypic and genotypic data, genomic estimated breeding values (GEBVs) were calculated by leave-one-out cross-validation (LOOCV) in six GS models: parametric (RR-BLUP, BA, BL) and non-parametric (RKHS, SVM, RF). Prediction accuracy for BW resistance was evaluated using the Pearson correlation coefficients between GEBVs and observed phenotypes. The GS models showed similar levels of prediction accuracy in both collections. Therefore, the RR-BLUP model was used for further analysis due to its computing time. For four phenotypic data sets, prediction accuracy was higher in BLUP (0.534 and 0.681) relative to the other data sets (0.315 to 0.645). In addition, when each collection was used as a testing population, the prediction accuracy was 0.549 and 0.471, suggesting that the two collections have different genetic backgrounds. To improve prediction accuracy in testing populations, two collections were combined as a training population (n=354). Subsequently, nine subsets of markers (48 to 12,288 SNPs) were randomly selected, and all of these showed lower prediction accuracy (0.422 to 0.619) than 31,330 SNPs (0.621). In contrast, GWAS-based and marker effect-based subsets showed similar or higher levels of prediction accuracy (0.581 to 0.764) relative to that of 31,330 SNPs. Since the highest prediction accuracy was found in marker effect-based 1,536 SNPs, we re-estimated their marker effects in the combined training population and then 96 SNPs were selected as a core set of markers for genomic selection of BW resistance. The prediction accuracy of this marker set was 0.761, suggesting its efficiency as a molecular tool for improving BW resistance in tomato breeding programs.

벼흰잎마름병에 대한 저항성에 관여하는 벼 Orphan 유전자들의 분리와 연구

이현지 세종대학교 일반대학원 2023 국내석사

Watermelon (Citrullus lanatus) and muskmelon (Cucumis melo), members of the Cucurbitaceae, are economically important fruit crops in Korea. Various viruses are responsible for major diseases leading to a significant loss in their production. In our study, the incidence of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), watermelon mosaic virus (WMV), and melon necrotic spot virus (MNSV) was investigated from diseased watermelon and muskmelon leaves with typical virus symptoms collected from 67 fields in Korea. A total of 123 ZYMV, WMV and MNSV infection samples were found from 2019 to 2022, and the detected viruses were 74 of ZYMV, 27 of WMV, and 50 of MNSV. The areas with the highest infection rates were ZYMV and MNSV in Cheongyang (2020), WMV in Yangpyeong (2022). Among ZYMV isolates, YG211-2 and YG211-6 are classified as subgroup II of ZYMV group A. Most of the WMV isolates were classified as subgroup I of WMV group A evolved with the China and USA strains. MNSV isolates are clustered into two separate groups muskmelon group and watermelon group. In mixed infection sample, ZYMV+MNSV was found the most, which showed an infection rate of 6.7%, ZYMV+WMV showed 3.6%, and WMV+MNSV showed 0.8%. Our results are reports of genetic analysis and infection rates of single and mixed infections occurring in watermelons and muskmelons in Korea. 벼(Oryza sativa L.)는 가장 중요한 식량자원이며 세계 인구 중 절반의 주식이다. 그러나 온실 가스 배출과 지구 온난화 등으로 인한 기후 변화와 그에 따른 새로운 병해충의 출현은 가까운 미래에 벼의 생산량에 영향을 끼칠 것으로 생각된다. 이에 대응하여 세계인들의 높은 수요를 꾸준히 충족시키기 위해서는 미래형 벼가 만들어질 필요가 있다. 벼흰잎마름병을 일으키는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)는 우리 나라 뿐만 아니라 세계적으로도 벼 생산에 직접적인 영향을 주어 심각한 수확량 감소(최대 50%)를 야기하고 있다. 따라서 Xoo에 대하여 병저항성 반응을 이끌어 낼 수 있는 신규 유전자 후보들을 발굴하기 위하여 orphan 유전자 Os07g39860와 Os02g05430를 연구하였다. Orphan 유전자는 다른 진화 계통의 유전자와는 상동성이 결여되어 있고 종종 기원의 시작을 알 수 없는 유전자를 말한다. 실험에서는 Xoo에 대한 저항성을 유도하는 면역 수용체인 Xa21을 과발현 시킨 형질전환체에 Xoo의 pathogen-associated molecular pattern (PAMP)인 합성 펩타이드 RaxX21-sY를 처리하였다. 그 결과 orphan 유전자인 Os07g39860와 Os02g05430 모두 RaxX21-sY 처리 후에 특이적 발현 증가가 나타났다. 각각의 orphan 유전자가 Xoo에 대한 저항성 반응에 직접적으로 기여하는지 조사하기 위하여 각 유전자를 Xoo에 대해 감수성 벼 재배종인 Kitaake에 과발현 시켜 형질전환체를 제작하였다. Xoo 접종 결과는 감수성인 Kitaake에서는 평균 병변 길이가 19.1 cm인 반면 Os07g39860을 과발현 시킨 벼 형질전환체 5D line과 8A line에서 15.4 cm와 14 cm인 짧은 병변 길이가 나타났다. 또 Os02g05430을 과발현 시킨 벼 형질전환체 4C와 5A line에서는 평균 병변 길이 14 cm와 14.08 cm로 병변 길이 18.8 cm인 감수성 Kitaake에 비하여 더 짧은 길이를 보였다. 추가적으로 orphan 유전자들에 대한 기능 연구를 위해 담배(Nicotiana benthamiana)에 임시발현 시킨 결과 Os07g39860의 경우 발현 부위에 세포사멸(cell death)을 일으켰으나 Os02g05430의 경우 눈에 띄는 변화를 보여주지 않았다. 따라서 실험들에 대한 결과를 종합해보았을 때 과발현 벼에서 부분 저항성과 담배에서 세포사멸을 보인 Os07g39860과, 과발현 벼에서 부분 저항성을 보인 Os02g05430은 Xoo에 의해 발병하는 벼흰잎마름병의 병저항성 반응에 관여할 가능성이 높은 유전자라고 판단하였다. 따라서 이상의 orphan 유전자들의 아직 밝혀지지 않은 병저항성에 관련된 기능을 추가 연구하는 것이 필요하다고 생각된다. Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important food crops and serves as a staple food source for more than half the world's population. However, climate change caused by greenhouse gas emissions, global warming, and new emerging diseases are affecting rice production seriously. In order to consistently meet high demand of rice, we need to have a future rice plant resistant to biotic and abiotic stresses. Rice bacterial blight caused by Gram-negative pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is one of the most destructive diseases worldwide. Orphan genes lack homogeneity with other genes in distantly related species and because their function has not been studied, the genes are often annotated as “expressed protein”. They are evolutionary important for understanding lineage-specific adaptations including acquirement of resistance to pathogens. In this study, I isolated two putative orphan genes and examined whether they are involved in the resistance against Xoo. In rice, PRR Xa21-mediated immune response is initiated after recognition of the pathogen associated molecular pattern (PAMP) RaxX-sY (required for activation of Xa21-mediated immunity X, tyrosine-sulfated) produced by Xoo. After treatment of synthetic RaxX21-sY, orphan genes, Os07g39860 and Os02g05430, were clearly induced in Xa21 rice plants. Rice transgenic plants overexpressing each orphan genes were produced to determine disease resistance to Xoo. After Xoo inoculation, the average lesion lengths of transgenic plants overexpressing Os07g39860 and Os02g05430 were shorter than ones from Kitaake control. In transient expression using Agro-infiltration in Nicotiana benthamiana, Os07g39860 triggered cell death but Os02g05430 did not. Therefore, based on the results of the experiments, I concluded that Os07g39860 and Os02g05430 are likely to be involved in disease resistance to rice bacterial blight. Therefore, it will be necessary to further study the in vivo function and molecular mechanism of the orphan genes, Os07g39860 and Os02g05430, related to the disease resistance.

CRISPR/Cas9을 이용한 토마토 PDS 유전자 교정

이희준 세종대학교 대학원 2024 국내석사

Study on the regulation of JNK signal activation by the nuclear membrane protein Emerin

이영광 세종대학교 대학원 2024 국내석사

JNK 신호는 세포의 발생, 증식, 분화, 세포자살 등 세포 운명 결정자로 작용하며, 생명유지에 필수적인 전사인자들의 활성을 조절함으로써 암 발생등의 다양한 질환발병에도 관련이 있다. 핵막은 일반적으로 세포 핵의 구조를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 하지만 최근 연구들을 통해서 핵막 단백질들 간의 유기적인 네트워크 시스템은 핵 외부로 나가는 전사유전자 및 핵 내부로 들어오는 신호전달 단백질들과의 결합을 통해 다양한 환경에 대응하여 유전자 발현을 조절하는 역할이 강조되고 있다. 이전 연구에서는 핵막의 핵심 단백질인 에머린(Emerin)이 암 성장과 관련된 신호전달 분자인 STAT3과 결합하여 강력한 신호 억제 효과를 나타낸다는 것을 확인했다. 또한, STAT3의 전사 활성 감소를 통해 상위 신호인 MAPK의 발현에도 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사했다. 이 연구에 기초하여, Emerin에 의한 MAPK family인 JNK의 활성 억제 가능성에 중점을 둔 연구를 진행하였다. 자궁경부 암세포인 HeLa 세포에서 루시퍼레이즈 분석 실험을 진행하여, Emerin이 JNK신호를 억제한다는 것을 확인하였다. Emerin에 의한 JNK와 하위 타겟 유전자의 발현 변화를 알아보기 위한 실시간 PCR(qRT-PCR) 실험을 하여, JNK와 그 하위타겟 유전자의 발현이 JNK 억제제와 유사하게 Emerin에 의해 억제됨을 확인하였다. Emerin의 JNK억제 기작을 탐색하기위해 웨스턴 블로팅과 세포분획법 실험을 하여 내인성으로 발현되거나 과발현된 Emerin이 JNK 단백질을 억제하며, 핵으로의 이동을 방해하는 것을 규명하였다. 상호작용하는 지점을 파악하기 위한 면역세포화학(ICC), 면역침강법(Co-IP) 실험들을 진행하여, Emerin이 위치한 핵막에서 JNK와 상호작용함을 확인하였다. Emerin에 의한 JNK 억제가 근육에 어떤 영향을 미칠지 알아보기 위해, 생쥐 근아세포인 C2C12 세포에서 면역세포화학, 웨스턴 블로팅 실험을 하여, Emerin knockdown에 의한 JNK 억제 감소가 근육세포 분화를 조절함을 확인하였다. 또한, zebrafish 꼬리 근육에서도 불균형을 보이며, JNK 신호는 근육 재생과 근육으로 분화 간 균형에 중요함을 확인하였다. Emerin이 핵 안으로 들어온 여러 신호인자들의 작용 순서를 결정하는 ‘universal signaling gatekeeper’ 로 기능할 수 있음을 세포 운명을 결정하는 주요 신호인 JNK의 활성조절 연구를 통해 제시하고자 한다. JNK signaling acts as a determinant of cell fate, including cell development, proliferation, differentiation, and apoptosis. It is also involved in the development of various diseases such as cancer by regulating the activity of transcription factors essential for maintaining cell life. The nuclear membrane generally plays an important role in maintaining the structure of the cell nucleus. However, recent studies have emphasized the role of the organic network system of nuclear membrane proteins in regulating gene expression in response to various environments through the binding of transcription genes that go out of the nucleus and signal transduction proteins that enter the nucleus. Previous research confirmed that Emerin, a key protein in the nuclear membrane, binds to STAT3, a signaling molecule related to cancer proliferation, and strongly inhibits signal transduction. In addition, it was suggested that the expression of MAPK, an upstream signal, may be negatively affected through a decrease in the transcriptional activity of STAT3. Based on this study, research was conducted focusing on the possibility that the activity of JNK, a member of the MAPK family, may be inhibited by Emerin. Luciferase assays were performed in HeLa cells to confirm that Emerin inhibits JNK signaling. A Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) experiment was performed to determine changes in the expression of JNK and its downstream target genes by Emerin, and it was confirmed that the expression of JNK and its downstream target genes was suppressed by Emerin, like a JNK inhibitor. To explore the mechanism of JNK inhibition by Emerin, Western blotting and cell fractionation experiments were performed to determine that endogenously expressed or overexpressed Emerin inhibits JNK protein and prevents its translocation to the nucleus. Immunocytochemistry (ICC) and Co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments were performed to determine the location of the interaction, confirming that Emerin interacts with JNK in the nuclear membrane where it is located. To determine what effect JNK inhibition by Emerin would have on muscle, immunocytochemistry and Western blotting experiments were performed in mouse myoblast cells, C2C12, to confirm that reduction of JNK inhibition by Emerin knockdown regulates muscle differentiation. In addition, Emerin knockout resulted in muscle abnormalities in zebrafish tail muscles, and it was confirmed that JNK signaling is important for the balance between muscle regeneration and muscle cell differentiation. It is proposed here that Emerin can function as a "universal signaling gatekeeper" that determines the order of action of various signaling factors entering the nucleus by regulating the activity of JNK, a key signal that determines cell fate.

무(Raphanus sativus L.) 자가불화합 대립유전자에 따른 종자생산력 검정

장재석 세종대학교 대학원 2024 국내석사

무(Raphanus sativus L.)는 배추과(Brassicaceae)작물로서 우리나라에서 채소작물 중 네번째로 많이 재배되는 식물이다. 무는 자가불화합성(self- incompatibility)을 가지고 있으며, 이러한 현상은 대규모 무 F1 종자 생산에 활용된다. 그러나, 부모친으로 사용되는 무 계통의 S haplotype 별로 화합성 지수(Compatibility Index)가 다르며, 이에 따라 종자생산력에 차이를 보이는 경우가 있기 때문에 반드시 F1 교배조합 선정 시 부모친의 S haplotype을 선 정하는 것이 중요하다. 종자생산력을 알아보기 위해서 12가지의 S haplotype(S1, S2, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S15, S21, S22)을 각각 가지는 것으로 추정되는 23개 무 S 동형접합자 계통을 사용하여 기존에 개발된 S haplotype specific marker 12종을 가지고 genotyping을 수행하였고 23개의 무 S 동형접 합자 계통 모두 12개의 S haplotype을 동형으로 가지고 있음을 확인할 수 있 었다. 12개의 S haplotype이 동형으로 확인된 23개 계통을 사용하여 F1 교배 조합을 작성하였다. 실험은 4개의 하우스에서 진행했으며, house 1은 S1, house 2는 S10, house 3은 S5, house 4는 S8의 각각의 S1, S5, S8, S10 S haplotype 을 가진 계통을 부계로 사용하였고, 같은 인자를 가진 대조구 S1, S5, S8을 포함하는 12가지 S haplotype의 MS 계통을 모계로 사용하여 F1 교배조합 실 험을 실시하였다. 실험결과, 58개 교배조합 중 오직 18개의 F1 교배조합만 이 종자를 250개 이상 생산하였고, 이를 기존에 개발된 11종 S haplotype specific primer를 이용하여 genotyping과 순도검정을 수행하였다. 실험결과 18개의 F1 교배조합이 부모친의 S haplotype을 각각 이형접합으로 가지는 것 을 확인할 수 있었다. F1 종자생산력 및 교배화합성 검정을 위해서 교배조 합에 대하여 인공수분과 충매수분을 나누어 수행하였다. 첫 번째, 각 조합 당 20개의 꽃을 인공적으로 개화수분을 수행하여 각 교배 조합의 화합성지 수와 꼬투리 형성률을 계산하여 교배화합성 검정을 수행하고, 두 번째, 충 매수분을 통해 나온 각 교배 조합의 꼬투리 100개에서 종자수, 꼬투리 1개 당 종자수, 꼬투리 표현형 조사를 통해 종자생산력을 검정하고자 하였다. 실험결과 각 하우스마다 부계가 같고 모계만 다른 교배조합이었지만 꼬투 리 모양과 생산량이 매우 다름을 알 수 있었다. 각 하우스의 교배조합에 따 라 꼬투리의 표현형과 종자수 간의 상관관계를 볼 때 대체적으로 꼬투리 너비가 넓으면 종자수가 많고, 꼬투리 길이가 길면 종자수가 많은 것으로 조사되었다. 또한 인공수분을 한 38개 교배조합을 통한 화합성 지수를 비교 하여 볼 때 부계의 S haplotype과 상관없이 모든 하우스에서 S6, S7, S22 S haplotype을 가지는 모계를 사용할 때 조합능력이 우수한 것으로 나타났다. 추후 다른 S haplotype을 가진 부계를 사용한 교배실험이 필요하지만 본 실 험 결과에서는 S6, S7, S22 S haplotype을 가진 모계 계통을 이용하였을 경우 무 F1 품종 육성시 종자생산량이 많은 F1 품종을 개발할 수 있으리라 기대 된다. 주요어: Radish, S haplotype specific marker, 화합성 지수, 꼬투리 형성률, 조 합능력검정