http://chineseinput.net/에서 pinyin(병음)방식으로 중국어를 변환할 수 있습니다.
변환된 중국어를 복사하여 사용하시면 됩니다.
- 中文 을 입력하시려면 zhongwen을 입력하시고 space를누르시면됩니다.
- 北京 을 입력하시려면 beijing을 입력하시고 space를 누르시면 됩니다.
RISS 인기검색어
- 검색키워드
- 저자 : Thao DangHien Tran (검색결과 1 건)
-
Role of heat shock protein ClpL in streptococcus pneumoniae
Thao DangHien Tran 성균관대학교 일반대학원 2010 국내박사
폐렴구균 ClpL은 HSP/Clp(caseinolytic protease)family에 속하며 진핵생물과 원핵생물 모두에서 존재한다. HSP100/Clp family는 serine type peptidase ClpP subunit과 regulatory ATPase subunit으로 구성되어 있다. 폐렴구균의 ClpL은 2개의 ATP binding 구역을 가지는 단백질이다. ClpL이 최근까지 병원성 유전자 발현의 조절 및 숙주세포 부착을 감소시키며 초기 감염 단계에서의 actin polymerization에 의한 TNF-α 분비 유도에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, molecular chaperone의 특별한 활성은 많이 알려지지 않았다. 폐렴구균은 community-associated 폐렴, 중이염, 패혈증, 수막염의 주요한 원인균으로 많이 알려져 있다. 그 중 폐렴은 감염 중에서 가장 높은 질병율과 사망률을 가지며, 미국 내 6번째 사망원인이다. β-lactam 항생제는 폐렴쌍구균의 폐렴에 대부분 투여 된다. 항생제 내성은 세계 건강에 증가되는 위협이다. 비록 상당히 많이 항생제 저항 유전자들이 밝혀졌 지만, 세포벽의 생합성 효소의 조절에 의한 penicillin 저항 증가는 아직 발표되지 않았다. 이번 연구의 목적은 폐렴구균의 증가된 내성에서 ClpL의 역할 탐색과 생화학적 특성의 밝히는 것이다. 폐렴구균에서 ClpL에 의해 페니실린 내성이 유도되는 것을 탐색하였다. ClpL이 결핍된 mutant (△clpL)에서는 페니실린에 좀 더 민감하였고 야생형 보다 얇은 세포벽을 가졌다. 이에 반해서 ClpL overexpressing strain은 높은 페니실린 저항과 두꺼운 세포벽을 보였다. 이러한 결과는 D39와 두 가지 추가적 genetic backgrounds (capsule types 1 and 19)에서 관찰되었다. 또한, ClpL overexpression strain은 페니실린에 의한 사멸, Triton X-100과 deoxycholate에 의한 lysis에 야생형 보다 저항을 나타냈다. 페니실린에 노출된 폐렴구균은 야생형에서 ClpL과 PBP2X의 단백질 발현량이 농도-의존적으로 증가하였지만, △clpL에서는 PBP2X가 감소하였다. Quantitative RT-PCR과 RT-PCR 결과 야생형 박테리아에 페니실린이 노출되었을 때 ClpL, pbp2X 그리고 murM의 발현이 강하게 영향을 받음을 확인하였다. 또한, 열 충격을 가했을 때 야생형에서 세포 벽 합성 유전자 pbp2X의 합성이 mRNA와 protein level에서 ClpL 의존적으로 증가하여 유도되었지만, △clpL에서는 그렇지 않았다. 이러한 기작을 더 연구하기 위해, 세포 분획을 통하여 ClpL과 PBP2X의 위치를 측정하였다. 그 결과 열 충격에 의해 유도된 ClpL은 세포벽에 위치하였으며, 그리고 △clpL은 특이하게 세포벽 내부로 PBP2X의 translocation이 유도 되었다. 또한, co-immunoprecipitation에서 ClpL과 PBP2X의 상호작용을 확인하였으며, ClpLHis6 또는 PBP2xHis6을 통한 His-tag pull-down assay로 앞의 결과를 재차 확인하였다. 따라서 실험 조건하에 ClpL은 pbp2x를 유도하여 세포벽 합성을 자극하고, PBP2x와 상호작용함으로 써 PBP2x의 translocation을 촉진 하는 것으로 판단된다. 이 결과는 항생제 내성이 스트레스 반응에 의해 발생될 수 있는 첫 번째 증거이다. ClpL은 자기 스스로 ATP 의존적 chaperone 반응을 할 수 있다. ClpL의 Chaperone 활성을 밝히는데, site 특이적 돌연변이 주형 recombinant ClpL가 사용되었다. K127T mutation은 ClpL의 ATPase와 chaperone 활성을 억제한다. CD spectra와 native PAGE 결과 oxidative와 reductive 조건에서 ClpL의 구조가 변화 하는 것을 확인하였다. 또한, hydropgen peroxide 조건에서 ClpL 과 bis-ANS의 결합은 감소하였다. 그러한 변화는 in vitro에서 ClpL의 chaperone 활성의 감소를 강하게 가져오며, 높은 온도에서 D39 야생형 단백질이 in vivo 내에서 △clpL보다 좀더 soluble 하게 도와준다. 흥미롭게도, ClpL이 자기 스스로 변성된 protein과 결합 할 수 있는 것 또한 확인하였으며, 높은 온도에서 단백질의 침전을 방지, 변성된 단백질을 분해하는 등 HSP100 protein과는 다른 독특한 특징을 나 타낸다. 전체적으로 이러한 결과는 산화적 스트레스에 대해 ClpL 단백질이 ATP 의존적으로 chaperone 구조 변화, 결합, 분해 그리고 다른 chaperone 또는 adaptor protein의 도움 없이 변성 단백질의 재구조화하는 독특한 특징을 나타냈다. 이후 ClpL의 구조 분석을 통해 조금 더 중점적으로 ClpL chaperone 분자가 폐렴구균 내 어떻게 기능을 하는지를 탐구해야 할 것이다. Streptococcus pneumoniae ClpL belongs to HSP100/Clp (caseinolytic protease) family, which is present both in eukaryotes and prokaryotes. HSP100/Clp family is composed of a serine type peptidase ClpP subunit and a regulatory ATPase subunit. ClpL in S. pneumoniae is a regulatory subunit protein containing two ATP binding regions. Although ClpL was recently demonstrated to play a very important role in modulating virulence gene expression, repressing adherence of S. pneumoniae to host cells, and inducing secretion of TNF-a via actin polymerization at the initial stage of infection, little is known regarding its specific activity as a molecular chaperone. S. pneumoniae is well-known as a dominant cause of community-associated pneumonia, otitis media, septicemia, and meningitis. Pneumonia has been one of the highest morbidity and mortality rates from infections, and is the sixth-leading cause of death in the United States. b-lactam antibiotics are the most common treatment for pneumococcal pneumonia. Antibiotic resistance has been an increasing threat to global health. Although substantial progress has been made to identify antibiotic resistance genes, no study has been reported on the modulator of cell wall biosynthetic enzymes leading to an increase in penicillin resistance of S. pneumoniae. The purpose of this study was to investigate the role of ClpL in the increasing resistance of S. pneumoniae and to characterize its biochemical characteristics. It was found that penicillin resistance in S. pneumoniae was induced by ClpL. A mutant lacking ClpL (deltaclpL) was more susceptible to penicillin and had thinner cell wall than the parental strain whereas a ClpL overexpressing strain shows a higher resistance to penicillin and a thicker cell wall. These results were observed in D39 and on two additional genetic backgrounds (capsule types 1 and 19). In addition, the ClpL overexpressing strain was more resistant to killing by penicillin, and lysis by Triton X-100, and deoxycholate than the WT. Exposing pneumococci to penicillin caused a dose-dependently increase of the rotein expression level of ClpL and PBP2x in the WT, but decreased that of PBP2x in the deltaclpL. Quantitative RT-PCR and RT-PCR data showed that expression of clpL, pbp2x, and murM was strongly affected when D39 WT bacteria were exposed to penicillin. Moreover, heat shock induced a ClpL-dependent increase in the mRNA and protein levels synthesized by the major cell wall synthesis gene pbp2x in the WT, but not in the deltaclpL. In order to further investigate the mechanism, localization of ClpL and PBP2x was analyzed by fractionation assay. The data revealed that ClpL induced by heat shock was localized at the cell wall, and the deltaclpL showed significantly reduced translocation of PBP2x into the cell wall. Moreover, co-immunoprecipitation showed an interaction of ClpL with PBP2x. This interaction was further confirmed in His-tag pull-down assays with either ClpLHis6 or PBP2xHis6. Thus, under the tested conditions, ClpL appears to stimulate cell wall synthesis by inducing pbp2x, interacting with PBP2x, and facilitating translocation of PBP2x. This is the first demonstration that antibiotic resistance could be generated by a stress response. ClpL itself could act as an ATP-dependent chaperone. To characterize chaperone activity of ClpL further, recombinant ClpL with a site specific mutation was used. K127T mutation blocks both ATPase and chaperone activity of ClpL. CD spectra and native PAGE data revealed that structure of ClpL was changed in oxidative and reductive condition. Moreover, the binding of ClpL to bis-ANS was decreased in the presence of hydrogen peroxide. These changes might lead to the increase of chaperone activity of ClpL in vitro, and could help total proteins of D39 WT be more soluble in vivo than that of deltaclpL at high temperature. Interestingly, it was also found that ClpL itself could bind denatured protein, prevent proteins aggregation at high temperature, and disaggregate denatured proteins, a unique character among HSP100 proteins. Taken together, these data showed that the distinctive ClpL protein functioning as an ATP dependent chaperone indeed changed its structure in response to oxidative stress, bound, disaggregated and refolded denatured protein without the need of another chaperone or an adaptor protein. Further studies on the crystal structure of ClpL might be required to explain in more detail how ClpL chaperone molecule plays such many important functions in S. pneumoniae.
연관 검색어 추천
이 검색어로 많이 본 자료
활용도 높은 자료
