Vibrio parahaemolyticus 바이오필름의 분자생물학적 특성 및 새우, 식품접촉표면 생성 바이오필름 제어 연구

풀카눌 라흐만 중앙대학교 대학원 2017 국내박사

제 1 장에서는 환경 및 임상시료로부터 분리된 Vibrio균주의 바이오필름 형성과 운동성, exoprotease 생산, 쿼럼센싱(quorum sensing, QS)형성과 병원성에 대한 분자생물학적 특징에 대해 연구하였다. 본 연구에서는 수산물에서 분리된 22종의 균주를 사용하여 바이오필름 형성능과 쿼럼센싱(QS), swimming 운동성 또는 소수성 간에 상관관계에 대해 조사하였다. 본 연구결과, V. parahaemolyticus 의 바이오필름 형성 능력이 세포표면의 소수성, 자가유도인자(AI-2) 생산 및 protease 활성과 명확한 상관관계가 있음을 보였다. Field emission scanning electron microscopy (FESEM)을 통해 바이오필름 형성 능력이 강한 균주는 두꺼운 3차원 구조를 형성하는 반면, 바이오필름 형성 능력이 약한 균주는 얇은 구조를 형성하였다. 또한, 수산물 유래 V. parahaemolyticus의 Genes encoding pandemic clone factors의 분포와 type VI secretion systems (T6SS), 바이오필름 functions, the type I pilus의 관계를 규명했다. 바이오필름 관련 유전자는 거의 모든 균주에 존재했는데, 이 결과는 해산물에서 바이오필름 형성이 V. parahaemolyticus 질병의 전파와 교차오염의 주요 요인이 될 수 있음을 나타낸다. 제 2 장에서는 환경 및 임상 시료에서 분리된 비브리오균 (V. parahaemolyticus)의 유전형 분석과 쿼럼센싱분자(AI-2) 검출에 대해 연구하였다. 이 연구에서 Ultrafast labChip real-time PCR 분석은 병원성 V. parahaemolyticus 균주의 신속한 검출 및 정량화를 위해 수행되었다. 이때, Escherichia coli 및 V. harveyi를 음성 대조군으로 사용하였다. 26개의 tdh-양성, 바이오필름 형성 V. parahaemolyticus 분리균주는 repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction (REP-PCR)에 의해 분석되었다. REP-PCR 분석 결과, V. parahaemolyticus 균주는 수산물에서 유래되었으며, 임상표본은 92.8%와 32%의 유사성 수준에서 두 개의 주요 집단을 형성했다. AI-2의 존재 및 정량화는 2,3-diaminonaphthalene으로 AI-2를 유도체화 한 후 형광 검출 high performance liquid chromatography (HPLC-FLD)을 사용하여 수행되었다. 해양에서 tdh-양성 V. parahaemolyticus의 존재는 공중보건을 위협하므로 지속적인 환경 모니터링이 필요할 것으로 사료된다. 제 3 장에서는 블랙타이거새우 표면에 NaCl 및 포도당 처리가 V. parahaemolyticus 바이오필름 형성 및 쿼럼센싱(QS) 자가유도인자(AI-2) 생산에미치는 효과를 평가하였다. NaCl 농도는 최대바이오필름 형성(~ 6.3 log CFU/cm2)을 얻기 위해 최적화되었으며, 포도당의 억제효과는 최적화 된 NaCl 농도에 첨가되어 수행되었다. 0.5-3.0% NaCl 농도의 배양조건에서 균은 증가된 바이오필름 형성을 보였다. 그러나 NaCl 농도 4.0-5.0% 에서 AI-2의 생산은 감소되었다. 0.005-0.015% 포도당 (2% NaCl을 함유 한 Luria Bertani (LB) 배지에 보충)첨가 배양조건 또한 바이오필름 형성 및 AI-2 생산을 증가시켰지만, 0.02-0.05%의 포도당 조건에서는 바이오필름 형성 및 AI-2 생산이 감소되었다. FESEM 사진은 2% NaCl을 함유 한 0.01% 및 0.015% 포도당 보충 LB 배지에서 광범위한 바이오필름 형성을 보인 반면, 0.05% 포도당은 세포 손상과 함께 부착능을 증진시키는 것으로 관찰되었다. 전체적으로 0.01-0.015%의 포도당과 2%의 NaCl이 보충된 LB 배지로부터 새우 표면에서 더 높은 바이오필름 형성과 AI-2 생산을 보였다. 결론적으로, 저염분 환경에서 잠재적으로 병원성 비브리오 종에 의해 오염된 새우는 잠재적으로 보건상 위험을 초래할 수 있다고 판단된다. 제 4 장에서는 Essential oils (Eos) 처리에 따른 V. parahaemolyticus 부유세균의 성장과 운동성, 바이오필름 형성및 쿼럼센싱(QS)에 대해 연구하였다. 또한, EO 처리의 최소저해농도 (minimum inhibitory concentrations, MIC)와 최소살균농도 (minimum bactericidal concentrations, MBC)에 대해 조사하였다. 그 결과, 모든 Eos는 MBC가 0.02 ~ 0.9% 범위 내에 분포했다. Clove oil (CO)과 thyme oil (TO)은 MIC의 4배 농도에서 10분간 처리 후 부유세균의 성장을 완전히 억제했고, garlic oil (GO)는 MIC의 4배 농도에서 20분 처리 후 성장을 억제시켰다. 특히, 모든 Eos처리는 MIC의 4배 농도에서 부유세균의 운동성을 유의적으로 감소시켰고, MIC의 8배 농도에서 30분 처리 시 쿼럼센싱(QS)을 억제하고 바이오필름 형성을 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한, FESEM 과 confocal laser scanning microscopy (CLSM)을 통해 30 분간 처리 시 V. parahaemolyticus 바이오필름(in vitro)에서 Eos의 항바이오필름 효과가 육안으로 확인되었다. 결론적으로, Eos는V. parahaemolyticus 성장, 운동성, 바이오필름 및 QS에 큰 영향을 주는 것으로 조사되었다. 위 결과는 실제 식품제조 환경에서의 추가 연구가 필요하나, CO, TO 및 GO가 식품가공환경에서 V. parahaemolyticus 바이오필름을 제어하는 데 잠재적으로 사용될 수 있음을 제안한다. In chapter 1, it was aimed to determine the correlation between biofilm formation and motility, exoprotease production and QS in environmental and clinical strains, and to evaluate molecular insights for biofilm formation and pathogenicity. Here, twenty-two Vibrio parahaemolyticus strains were analyzed for biofilm formation to determine whether there was a correlation between biofilm formation and quorum sensing (QS), swimming motility, or hydrophobicity. The biofilm formation ability of V. parahaemolyticus was positively correlated with cell surface hydrophobicity, autoinducer (AI-2) production, and protease activity. Field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) showed that strong-biofilm-forming strains established thick three-dimensional structures, whereas weak-biofilm-forming strains produced thin inconsistent biofilms. In addition, the distributions of genes encoding pandemic clone factors, type VI secretion systems (T6SS), biofilm functions, and type I pilus in the V. parahaemolyticus seafood isolates were examined. Biofilm-associated genes were present in all of the strains, irrespective of their phenotypes. These results indicate that biofilm formation on/in seafood may constitute a major factor in the dissemination of V. parahaemolyticus and ensuing diseases. In chapter 2, genotyping of V. parahaemolyticus strains isolated from environment/clinical cases and detection of QS molecule (AI-2) were investigated. An Ultrafast labchip real-time PCR assay was carried out for rapid detection and DNA quantification of pathogenic V. parahaemolyticus isolates. Escherichia coli and V. harveyi were used as negative controls. Twenty-six tdh-positive and biofilm-producing V. parahaemolyticus isolates were analyzed by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction (REP-PCR). REP-PCR analysis showed that the majority of V. parahaemolyticus isolates was originated from seafood and clinical specimens formed two major clusters at 92.8% and 32% similarity levels. The presence and detection of AI-2 were carried out using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection after derivatization of AI-2 with 2, 3-diaminonaphthalene. The presence of tdh-positive V. parahaemolyticus in marine samples highlights the need for constant environmental monitoring to protect public health. In chapter 3, the inhibition efficacy of NaCl and glucose on V. parahaemolyticus biofilm formation and AI-2 production on the black tiger shrimp surface was evaluated. NaCl concentration was optimized to obtain the maximum biofilm formation (~6.3 log CFU/cm2), and the inhibitory effect of glucose was later investigated with the optimized NaCl concentration. Cultures grown in 0.5-3.0% salinity showed increased biofilm formation, however the production of AI-2 was reduced at 4.0-5.0% salinity. Moreover, cultures grown in 0.005-0.015% glucose (supplemented in Luria Bertani (LB) media containing 2% NaCl) also showed elevated biofilm formation and AI-2 production; however they were decreased in the presence of 0.02-0.05% glucose. FE-SEM images showed extensive biofilm formation in 0.01-0.015% glucose supplemented with LB media containing 2% NaCl, whereas 0.05% glucose stimulated attachment with cell damage. Overall, 0.01-0.015% glucose with 2% NaCl in LB media showed greater biofilm formation and AI-2 production on the shrimp surface. Therefore, shrimps cultivated in low salinity environments that may be potentially contaminated with pathogenic Vibrio species may pose a potential health hazard. In chapter 4, the efficacy of three, generally recognized as safe (GRAS), essential oils (Eos) was investigated on the planktonic growth, motility, biofilms, and QS of V. parahaemolyticus. The minimum-inhibitory concentrations (MICs), and bactericidal concentrations (MBCs) were also investigated for three Eos. All Eos showed bactericidal activities with MICs ranging from 0.02 to 0.9%. Clove (CO) and thyme oil (TO) completely inhibited the planktonic growth after 10 min treatment; whereas garlic oil (GO) inhibited at 4 MIC after 20 min treatment. At 4 MIC, the motility of V. parahaemolyticus was significantly reduced by three Eos. Eos inhibited QS and reduced biofilm formation, at 8 MIC after 30 min treatment. The FE-SEM and confocal laser scanning microscopy (CLSM) had also visually confirmed that the anti-biofilm effects of Eos on V. parahaemolyticus biofilms (in vitro) for 30 min treatment duration. In conclusion, Eos affects V. parahaemolyticus growth, motility, biofilms and QS. The results suggest that CO, TO, and GO could potentially be used to control V. parahaemolyticus biofilms in food processing atmospheres, but further studies under commercial settings are required.