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      • 유산균의 포괄적 생균제로서의 항균 특성 분석 및 식품과 식품접촉표면에 오염된 Listeria monocytogenes Biofilm 억제 효과 연구

        이크발 호세인 중앙대학교 대학원 2020 국내박사

        RANK : 231983

        In chapter 1, we investigated the comprehensive molecular and probiotic characterization of anti-listerial lactic acid bacteria, and detection of quorum-sensing molecule (autoinducer-2) in lactic acid bacteria isolated from kimchi. In this study, six anti-listerial lactic acid bacteria (LAB) isolates were screened. These anti-listerial LAB isolates were identified by 16S rRNA gene sequencing and analyzed by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction (REF-PCR). Probiotic assessment of these isolates, comprising evaluation of the antibiotic susceptibility; tolerance to lysozyme, simulated gastric and intestinal juices, and gut conditions (low pH, bile salts, and 0.4% phenol), was carried out. Most of the isolates were resistant to streptomycin, vancomycin, gentamicin, kanamycin, and ciprofloxacin. All of the isolates were negative for virulence genes, including esp, agg, gelE, ccf, cylLL, cylLs, cyllM, cylB, and cylA, and hemolytic activity. Furthermore, autoinducer-2 (a quorum-sensing molecule) was detected and quantified by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) after derivatization with 2,3-diaminonaphthalene. This study indicates that these anti-listerial LAB isolates do not pose a risk to consumer health, that they are eco-friendly, and that they may be promising candidates for future use as bioprotective cultures and new probiotics to control contamination by Listeria monocytogenes in the food industry. In chapter 2, the main objective of this study was to investigate the inhibition efficacy of probiotics lactic acid bacteria (LAB) cells on Listeria monocytogenes biofilm formation. L. monocytogenes is a major foodborne pathogen which can attach on food and food contact surfaces for long time to develop the biofilm that adversely affects the food industry. Probiotics show great promise as alternative and environmentally friendly candidates to control microbial pathogens forming biofilm. Here, six isolated lactic acid bacteria (LAB) were chosen based on their anti-listerial activity. The anti-listerial activities of these isolates were evaluated by L. monocytogenes biofilm inhibition assays on stainless-steel coupons (SS), lettuce, and a minimum biofilm eradication concentration (MBECTM) biofilm device. Results revealed that following co-culture with LAB for 24 h, L. monocytogenes biofilm cells were inhibited by up to 2.17 log CFU/cm2, 1.62 log CFU/cm2, and 1.09 log CFU/peg on SS, lettuce, and MBECTM, respectively. However, these LAB bacteria prohibited L. monocytogenes biofilm formation on both surfaces, the inhibitory effect on lettuce surfaces was lower than that on SS. These results support the use of probiotic potential LAB to inhibit the formation of biofilm by pathogenic bacteria on vegetable products and in the food industry, without related risk to consumers. In chapter 3, the present study investigated the efficacy of postbiotics (metabolic byproduct of probiotics) collected from isolated Lactobacillus curvatus B.67 and Lactobacillus plantarum M.2 against Listeria monocytogenes pathogens in planktonic, motility, and biofilm mode. Owing to their preservatives and antimicrobial effects, postbiotics are promising natural ingredients for the food industry. The metabolites composition of postbiotics were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and high-performance liquid chromatography (HPLC). Minimum inhibitory concentration (MIC) of L. curvatus B.67 and L. plantarum M.2 for L. monocytogenes were confirmed as 80 and 70 mg/mL, respectively. Inhibition efficacy of four sub-MIC concentrations of postbiotics in bordering their MIC (1/16, 1/8, 1/4, and 1/2 MIC) were tested against L. monocytogenes during different experiment in this study. Swimming motility, biofilm formation, and as well as genomic expression levels of target factor related to biofilm formation, virulence, and quorum sensing (QS) regulating genes were significantly inhibited with increasing the postbiotics concentration. Our study demonstrate that the highest concentration (1/2 MIC) of L. curvatus B.67 producing postbiotics in this study inhibited biofilm cells up to 2.9, 3.2, 3.0 log CFU/cm2, and 3.3 log CFU/peg on rubber gloves, silicon rubber, plastic, and MBECTM surfaces; whereas L. plantarum M.2 producing postbiotics inhibited 3.5, 3.4, 3.5 log CFU/cm2, and 3.6 log CFU/peg, respectively. Biofilm inhibition effect of postbiotics was visually confirmed by field emission scanning electron microscopy (FESEM) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Overall, these study results suggest that these two postbiotics prepared from Lactobacillus spp. could be used as effective for control the L. monocytogenes biofilm in food industry. 프로바이오틱스는 미생물 병원체를 제어하기 위한 대안이고 환경친화적으로 큰 가능성을 보여준다. 제1장에서는 김치에서 분리한 항-리스테리아(anti-listeria) 유산균의 복합적인 분자, 생균제 특성 규명, 그리고 쿼럼-센싱 분자(autoinducer-2)에 대해 연구하였고, 6개의 서로 다른 항-리스테리아 유산균을 탐색하였다. 분리된 항-리스테리아 유산균은 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의해 확인되었고 REF-PCR로 분석되었다. 분리된 유산균을 대상으로 항생제와 장내 환경의 감수성을 평가하였는데 대부분의 분리균은 스트렙토마이신, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 그리고 시프로플로사신에 내성이었다. 모든 균은 독성 유전자인 esp, agg, gelE, ccf, cvlLL, cvlLs, cvllM, cvlB, cylA와 용혈 활성에 음성이었다. 또한, autoinducer-2를 2,3-diaminonaphthalene로 유도체화 한 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 형광 검출로 검출하고 정량하였다. 본 연구를 통해 분리된 항-리스테리아 유산균은 안전하며, 환경 친화적이기 때문에 새로운 생균제로서 식품산업의 Listeria monocytogenes를 제어하는데 유망한 수단임을 시사한다. 제2장의 목적은 L. monocytogenes에 대한 생균제 생성 유산균의 제어효과를 연구하는 것이다. L. monocytogenes는 식품과 식품접촉표면에 오랜 기간 부착 후 바이오필름을 형성하여 식품산업에 부정적인 영향을 미치는 주요한 식품매개 병원체이다. 생균제는 바이오필름을 형성하는 미생물 병원체를 제어하기 위한 친환경적인 대안으로 주목받고 있다. 6개의 분리된 유산균은 그들의 항-리스테리아 활성에 따라 선택되었다. 이들 분리균에 대한 항-리스테리아 활성은 스테인레스스틸, 상추, MBEC 장치에 형성된 L. monocytogenes 바이오필름 억제능력으로 평가되었다. 그 결과, 유산균과 함께 배양된 L. monocytogenes의 바이오필름은 스테인레스스틸, 상추, MBEC 장치에서 각각 2.17, 1.62 log CFU/cm2, 그리고 1.09 log CFU/peg가 감소되었다. 유산균은 스테인레스스틸과 상추의 표면에서 L. monocytogenes 바이오필름 형성을 억제하였지만, 상추에서의 억제 효과는 스테인레스스틸보다 낮았다. 이러한 결과는 소비자의 걱정없이 채소와 식품산업에서 병원성 세균이 형성하는 바이오필름을 억제하는데 잠재적인 생균제 유산균의 사용이 가능하다는 것을 뒷받침한다. 제3장은 Lactobacillus curvatus B.67와 Lactobacillus plantarum M.2에서 분리한 포스트 바이오틱스(생균제의 대사산물)의 L. monocytogenes의 부유세균, 운동성, 바이오필름에 대한 효과를 연구하였다. 포스트 바이오틱스는 방부, 항균효과로 인하여 식품산업에 유망한 천연성분이다. 포스트 바이오틱스의 대사산물 조성은 기체 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)과 HPLC에 의해 분석되었다. L. curvatus B.67와 L. plantarum M.2의 L. monocytogenes 최소억제농도 (MIC)는 각각 80, 70 mg/mL로 확인되었다. 본 실험을 진행하는 동안 포스트 바이오틱스의 L. monocytogenes에 대한 하위 최소억제농도 (1/16, 1/8, 1/4, 그리고 1/2 MIC)의 억제 효능도 확인하였다. 그 결과, 포스트 바이오틱스의 농도가 증가함에 따라 운동성, 바이오필름 형성, 바이오필름 형성에 따른 유전자 발형 정도, 독성, 쿼럼-센싱 조절 유전자는 유의적으로 감소하였다. 본 연구의 결과로 L. curvature B.67이 생성하는 포스트 바이오틱스가 높은 농도 (1/2 MIC)에서 고무, 실리콘, 플라스틱, MBEC 장치에 형성된 바이오필름을 각각 2.9, 3.2, 3.0 log CFU/cm2, 그리고 3.3 log CFU/peg감소시키고, L. plantarum M.4가 생성하는 포스트 바이오틱스는 동일한 농도에서 각각 3.5, 3.4, 3.5 log CFU/cm2, 그리고 3.6 log CFU/peg감소시키는 것으로 나타났다. 포스트 바이오틱스의 바이오필름 억제효과는 전계방출주사전자현미경(FESEM)과 공초점레이저주사현미경(CLSM)을 이용하여 시각적으로 확인되었다. 전반적으로, 이 연구결과는 Lactobacillus spp.으로부터 유래한 2가지 포스트 바이오틱스가 L. monocytogenes의 바이오필름을 제어하는데 효과적이었기에 식품산업에서의 사용 가능성을 제안한다.

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