Comparison of gene delivery method between cationic chemical reagent-mediated transfection and electroporation-mediated transfection in corporal smooth muscle cells = 음경해면체평활근세포에서 양이온성 화학전달체를 매개로 한 유전자 전달법과 전기충격법을 매개로 한 유전자 전달법의 비교

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

For gene therapy, non-viral gene delivery methods have been widely investigated to overcome viral gene delivery-associated problems despite its low transfection efficiencies. In this study, we evaluated the efficiency and safety of non-viral gene transfection methods using cation-based chemical reagents and electroporations by in vitro and in vivo experiments in corporal smooth muscle cells. To investigate the transfection efficiency and viability of cation-based chemical transfection methods, we used Lipofectamine® LTX & Plus™ reagent and X-tremeGENE HP reagent in human corporal smooth muscle (hCSM) cells. The experiments were also done in HEK 293 (a human embryonic kidney cell line) and A7r5 (a rat vascular smooth muscle cell line) as controls. To evaluate electroporation method, we used Neon™ Transfection System under various electrical conditions in hCSM cells. A plasmid vector, pIRES2-EGFP that encodes enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used. The transfection efficiency was evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry. The viability of the transfected cells was determined by MTT assay. After determination of optimal transfection method, in vivo experiments were performed. A cationic chemical reagent, in vivo-JetPEI® and a plasmid vector, pGL3-Luc that contains the firefly luciferase reporter gene were used in rat. Rats were divided into three groups: control, pGL3-Luc, pGL3-Luc/in vivo-JetPEI®. After 2 days of injection, gene expression was monitored using by bioluminescence imaging and the activity of luciferase was measured quantitatively. The transfection efficiency with Lipofectamine® LTX & Plus™ was 60.3±3.1%, 17.9±4.4%, and 33.4±4.5% in HEK 293, A7r5, and hCSM cell, respectively. The transfection efficiency with X-tremeGENE HP was 52.6±9.7%, 28.2±4.8%, and 11.4±4.1% in HEK 293, A7r5, and hCSM cell, respectively. The viabilities of A7r5 and hCSM cells in both cation-based chemical reagent groups were above 90%. With the electroporation method, primary hCSM exhibited a high transfection efficiency (73.3%) in optimized conditions (1400 v, 20 ms, 2 pulse), but the cell viability was lower than 55% in all electrical settings. In experiments with rats, the luciferase activity in pGL3-Luc/in vivo-JetPEI® complex group was significantly higher than pGL3 alone group (22,354 vs. 794.07 RLU/mg protein). Our results indicate that the gene transfection using cation-based chemical reagent is more optimal than electroporation method which is highly toxic in corporal smooth muscle cells. These data may be helpful for studies to evaluate candidate genes for the management of ED.

국문 초록 (Abstract)

일반적으로 유전자치료를 고려할 때, 바이러스를 이용하지 않는 유전자 전달법은 전달효율이 낮은 단점이 있으나, 바이러스를 이용한 유전자 전달법의 치명적인 단점들을 피할 수 있어 폭넓게 연구되고 있다. 본 연구에서는 음경해면체평활근세포에서 바이러스를 이용하지 않는 유전자 전달법 중 양이온성 화학전달체를 매개로 한 유전자 전달법과 전기충격법을 매개로 한 유전자 전달법의 효율 및 안전성을 연구하였다. 인체음경해면체평활근세포에서 양이온성 화학전달체를 이용한 유전자 전달법의 효율과 세포생존율을 조사하기 위하여, Lipofectamine® LTX & Plus™ 전달체와 X-tremeGENE HP 전달체를 이용하였으며, 인체배아신장세포주인 HEK 293과 백서혈관평활근세포주인 A7r5에서도 비교를 위하여 함께 실험하였다. 인체음경해면체평활근세포에서 전기충격법을 이용한 유전자 전달법을 평가하기 위하여 Neon™ Transfection System을 이용하였으며, 다양한 전기적 조건 하에 유전자 전달을 유도하였다. 유전자 전달효율을 평가하기 위한 벡터로서 녹색형광단백을 코딩하고 있는 pIRES2-EGFP를 이용하였다. 유전자효율은 형광현미경과 유세포분석법을 이용하여 평가하였다. 유전자 전달을 받은 세포의 생존율은 MTT 법을 이용하여 평가하였다. 체외 실험에서 음경해면체평활근세포에서 적합하다고 판단되는 유전자 전달법을 결정한 이후, 백서를 이용한 실험을 수행하였다. 양이온성 화학전달체로서는 in vivo-JetPEI®를 사용하였으며, 유전자 전달 정도를 평가하기 위한 벡터로서 반딧불이의 발광 효소를 코딩하고 있는 pGL3-Luc를 사용하였다. 실험에 이용한 백서는 3 그룹으로 나누어 각각 식염수, pGL3-Luc, pGL3-Luc/in vivo-JetPEI® 복합체를 음경해면체에 주입 하였다. 주입 2일 후, 생체발광 영상검사와 발광 효소의 정량적 분석을 통하여 유전자 발현을 평가하였다. Lipofectamine® LTX & Plus™ 전달체를 사용한 유전자 전달효율은 HEK 293, A7r5 세포 및 인체음경해면체평활근세포에서 각각 60.3±3.1%, 17.9±4.4%, 33.4±4.5% 이었다. X-tremeGENE HP 전달체를 사용한 유전자 전달효율은 각각 52.6±9.7%, 28.2±4.8%, 11.4±4.1% 이었다. 평활근세포인 A7r5와 인체음경해면체평활근세포에서 모두 양이온성 화학전달체의 유전자 전달효율은 90%를 상회하였다. 전기충격법을 이용하였을 때, 인체음경해면체평활근세포에서 유전자 전달효율은 매우 높았으며, 최적의 전기적인 조건에서는 73.3%에 달하였다. 하지만, 세포 생존율은 모든 전기적인 조건에서 55%를 넘지 못하였다. 백서를 이용한 실험에서 발광 효소의 활성도는 pGL3-Luc/in vivo-JetPEI® 복합제 투여 군에서 pGL3-Luc 단독 투여 군에 비하여 유의하게 높았다. (22,354 vs. 794.07 RLU/mg protein). 본 연구 결과, 음경해면체평활근세포에서 전기충격법을 매개로 한 유전자 전달법은 세포 독성이 높은 것을 확인할 수 있었으며, 양이온성 화학전달체를 매개로 한 유전자 전달법은 전달체를 이용하지 않은 방법에 비하여 전달효율을 높일 수 있으며 세포독성이 낮아, 전기충격법을 매개로 한 유전자 전달법에 비하여 적합하다고 판단되었다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 3
• II. Materials and methods 6
• 1. Cell preparation 6
• 2. Plasmid vectors 7
• 3. Gene transfection with chemical reagents 7
• 4. Gene transfection with electroporation 8
• 5. Fluorescence microscopy on transfected cells 9
• 6. Quantification of transfected cells 9
• 7. Cell viability assay 9
• 8. In vivo gene transfer into the corpus cavernosum 10
• 9. Preparation of PEI/plasmid complexes 11
• 10. Injection protocol in rats 11
• 11. In vivo bioluminescence imaging 12
• 12. Measurement of luciferase activity 12
• 13. Statistical analysis 13
• III. Results 14
• 1. Efficacy and toxicity of gene transfection by chemical reagents 14
• 2. Efficacy and toxicity of gene transfection by electroporation 15
• 3. Determination of transfection method for in vivo experiments 16
• 4. Luciferase activity in transfected isolated corpus cavernosal tissue 17
• IV. Discussion 19
• V. Conclusion 25
• Works Cited 26
• Appendix 27
• 논문요약 46