발효쌀겨의 항산화활성에 관한 연구 = Studies on antioxidative effects of fermented rice bran

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 쌀겨의 품질을 개선 할 수 있는 방안의 일환으로 쌀겨 발효 최적미생물을 이용하여 쌀겨를 발효하고, 이의 미생물 분포 특성을 확인하였다. 또한 발효쌀겨의 항산화활성을 바탕으로 3T3-L1 adipocytes 및 podocytes의 산화적 스트레스 모델에서 항산화효과를 검증하였다. 발효쌀겨의 생리활성물질 추출을 극대화하기 위하여 초고압 및 초고압/효소처리를 실시하였고, 이의 추출특성과 생리활성을 확인하였다. 본 연구는 쌀겨의 품질을 개선하여 식품 및 기능성 식품소재로 이용코자 그 가능성을 검토하였고, 그 결과는 아래와 같다.

1. 쌀겨의 발효를 위한 최적미생물인 Issatchenkia orientalis MFST1의 최적배양조건을 영양배지(potato dextrose broth), pH(5.1), 교반속도(150 rpm)는 고정한 상태에서 각 온도조건에서의 증식곡선을 산출한 결과 12시간 경과 후, 35 ℃의 배양온도조건에서 가장 먼저 대수증식기에 도달하였다.

2. 쌀겨에 25%의 수분 , 발효미생물 배양액을 처리하여 발효시킨 쌀겨의 미생물 분포를 확인한 결과 쌀겨, 수분첨가 쌀겨에서는 대장균군의 검출이 이루어졌으나, 멸균 및 비멸균 발효쌀겨에서는 대장균군이 검출되지 않았다. 또한 각 시료의 총 페놀성 화합물 함량과 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 일반 쌀겨에 비해 수분 첨가 후 배양한 군에서 페놀성 화합물의 함량과 DPPH radical 소거능이 높게 나타났다. 하지만 지속적인 품질 유지를 위하여 멸균한 발효쌀겨를 시료로 사용하였다.

3. 3T3 adipocytes에 hydrogen peroxide을 처리하여 인슐린 저항성(isulin resistance)을 유발한 후 발효쌀겨의 인슐린 저항성 개선효과를 glucose utilization, ROS generation, Oil red O 염색, 그리고 지방대사 및 당대사 관련 mRNA의 변화를 통해 검증하였다. 그 결과 발효쌀겨 추출물은 당 이용성에 있어서는 대조군과 유의적인 차이는 없었으나 ROS 생성억제, 인슐린 저항성 상태에서 adipogenesis 효과를 나타내었고, mRNA수준에서 PPAR-γ 및 adiponectin의 발현이 증가시켰다. 발효쌀겨의 유효활성 물질인 ferulic acid는 인슐린 저항성 상태에서 당 이용성 및 지방생성을 개선시켰고, mRNA 수준에서 GLUT4 및 adiponectin의 발현을 증가시켰다.

4. 사구체 혈관상피세포인 podocytes에 최종당화산물과 고농도의 glucose로 유발한 산화적 스트레스모델에서 발효쌀겨 추출물은 slit diaphragm의 기능유지에 중추적인 역할을 하는 podocin과 nephrin의 발현을 증가시켰으며, 염증매개인자인 IL-6의 발현은 감소시켰다. 또한 발효쌀겨의 유효활성물질인 ferulic acid를 처리하였을때 podocin과 nephrin의 발현을 정상수준으로 회복시켰다. 또한 단백질 수준에서 podocin의 발현은 ferulic acid의 처리에 의해 정상수준으로 회복되었다.

5. 발효쌀겨로부터 생리활성 성분 추출성을 극대화하기 위하여 초고압액화처리를 실시한 결과, 기존의 단순 열수 추출에 비해 추출성 및 생리활성이 증가하는 경향을 나타내었다.

본 연구결과, 발효쌀겨의 항산화활성은 그 기능성 성분인 ferulic acid로부터 기원되는 것으로 생각되며, 항산화활성을 바탕으로 건강기능성 식품 소재로 이용 가치가 있을 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this study is to improve the potential bioacitivity and quality stability of rice bran by fermentation with optimizing microorganism for rice bran. We have detected an optimizing microorganism for fermentation of rice bran from a rice mill. The microbial distribution property of the microorganism was confirmed. In order to investigate antioxidative effects of fermented rice bran, several oxidative stress models using 3T3-L1 adipocytes and glomerular visceral epithelial cell (podocyte) were used in this study. In order to maximize extractability of fermented rice bran (FRB), high pressure with/without enzymes extraction was studied and the characteristics of extracts and bioactivities were investigated. The results of this study were summarized as follows.

1. The Issatchenkia orientalis MFST1 is selected as the most optimal microorganism for fermentation of rice bran. The optimum culture condition for the Issatchenkia orientalis MFST1 is determined; potato dextrose broth fixed pH5.1 with agitation of 150rpm .Among different culture temperatures, the exponential growth phase firstly reached at 35℃ after 12hr culture.
2. The microbial distributions for fermented rice bran, raw rice bran (RB), water-added rice bran (AWRB) were investigated. The coli forms were detected in non-sterilized group of RB and AWRB, but no coli forms were detected in fermented rice bran group, no matter what sterilization is. Total volume of phenolic compounds and scavenging ability of DPPH in each samples were also analyzed.
3. To confirm whether FRB ameliorate insulin resistance or not with analyzing utilization of glucose, generation of reactive oxygen species (ROS), Oil red O stain, and expression of mRNA related to glucose homeostatsis and adipogenesis. FRB did not show a significant differentiations in glucose utilization study, but FRB strongly inhibited generation of ROS and upregulated PPAR-γ and adiponectin expressions. Ferulic acid (FA) as convincing potential antioxidative compound of FRB was also tested in same way mentioned above. FA showed a significant inhibition of ROS generation and up-regulation of GLUT4 related to glucose transportation and insulin sensitivity.
4. The podocyte-protective effect of FRB was investigated under oxidative stress induced by high glucose and advanced glycation end products (AGEs). The mRNA expression of podocin and nephrin which are pivotal molecules in slit diaphragm of podocyte were increased and IL-6 was decreased by FRB treatment compare to control. Pure FA also showed similar results with that of FRB increasing mRNA expression of podocin and nephrin. These results are also confirmed in protein levels by Western blots.
5. In order to improve the extractability of bioactive materials from FRB, high pressure treatment with/without enzymes to FRB was investigated. Extractability was improved by high pressure treatment than that of hot water treatment. FRB sample extracted by high pressure showed an improved bioactivity compared to hot water extracts.

Taken together, this study suggested that the potential bioacitivity and quality stability of rice bran are improved by fermentation with optimizing microorganism of Issatchenkia orientalis MFST1 for rice bran and FA is believed as a potential antioxidative compound of FRB, suggesting that FRB could be a useful materials for functional foods.

목차 (Table of Contents)

• 서론 1
• 재료 및 방법 8
• Ⅰ.발효쌀겨의 제조 및 이의 항산화효과 8
• 1. 발효미생물(Issatchenkia orientalis) 최적배양조건 확립 8
• 1) 실험설계 8
• 2) 최적배양조건 산출 8
• 3) 당 이용성 측정 8
• 2. 발효쌀겨의 제조 9
• 3. 발효쌀겨의 미생물 분포 9
• 4. 발효쌀겨의 항산화효과 9
• 1) 총 페놀성 화합물 함량 9
• 2) DPPH radical 소거능 11
• Ⅱ. 발효쌀겨 추출물의 인슐린 저항성(insulin resistance) 개선효과 12
• 1. 3T3-L1 adipocytes의 배양 및 시료투여 12
• 1) 3T3-L1 adipocytes의 배양 12
• 2) 시료투여 13
• 2. Glucose utilization assay 14
• 3. Reactive oxygen spices 측정 14
• 4. Oil red O 염색 14
• 5. RT-PCR 14
• 1) Total RNA 추출 15
• 2) cDNA 합성 15
• 3) PCR 반응 15
• Ⅲ. 사구체 혈관상피세포(podocytes)에서 발효쌀겨 추출물의 Advanced glycation end products(AGEs)로 유발한 산화적 스트레스 개선효과 17
• 1. Podocytes 배양 및 시료투여 17
• 1) Podocytes의 배양 17
• 2) Advanced glycation end products(AGEs)의 제조 17
• 3) 시료투여 18
• 2. RT-PCR 18
• 1) Total RNA 추출 18
• 2) cDNA 합성 18
• 3) PCR 반응 19
• 3. Western blot 분석 19
• Ⅳ. 초고압액화처리 발효쌀겨 추출물의 추출특성과 생리활성 22
• 1. 발효쌀겨의 제조 및 시료처리 22
• 2. 추출특성 24
• 1) 이화학적특성 24
• 2) 유리아미노산 함량 24
• 3. 항산화효과 25
• 1) 총 페놀성화합물 함량 25
• 2) DPPH radical 소거능 26
• 3) 환원력(reducing power) 측정 26
• 4) 지질과산화 억제능 측정 27
• 4. 효소활성억제효과 27
• 1) Tyrosinase 활성억제 27
• 2) Angiotensin converting enzyme(ACE) 28
• 결과 및 고찰 29
• Ⅰ.발효쌀겨의 제조 및 항산화효과 29
• 1. 발효미생물 최적배양조건 29
• 1) Issatchenkia orientalis 형태학적, 생리학적 특성 29
• 2) 발효미생물 최적배양조건 29
• 2. 발효쌀겨의 미생물 분포 32
• 3. 발효쌀겨의 항산화효과 34
• 1) 총 페놀성 화합물 함량 34
• 2) DPPH radical 소거능 34
• Ⅱ. 발효쌀겨 추출물의 인슐린저항성(insulin resistance) 개선효과 36
• 1. 인슐린저항성 상태에서 발효쌀겨 추출물의 glucose utilization 증가효과 36
• 2. 인슐린저항성 유도 3T3-L1 adipocytes에서 발효쌀겨 추출물의 reactive oxygen spices 생성억제효과 38
• 3. 인슐린저항성 상태에서 발효쌀겨 추출물의 3T3-L1 adipocytes의 지방생성(adipogenesis)효과 40
• 4. 지방대사 및 당 대사관련 분자의 mRNA 발현변화 43
• Ⅲ. 사구체 혈관상피세포(podocytes)에서 발효쌀겨 추출물의 Advanced glycation end products(AGEs)로 유발한 산화적 스트레스 개선효과 46
• 1. AGEs로 유발한 산화적 스트레스에서 발효쌀겨 추출물이 silt diaphragm(SD) 관련 인자의 mRNA 변화에 미치는 영향 46
• 2. 발효쌀겨 추출물의 투여에 의한 염증관련 cytokine의 mRNA 발현억제 49
• 3. 발효쌀겨 추출물의 유효활성물질로써 ferulic acid 처리에 의한 silt diaphargm의 기능유지 단백질 중 podocin의 단백질 발현 변화 51
• Ⅳ. 초고압액화처리 발효쌀겨 추출물의 추출특성과 생리활성 53
• 1. 초고압 액화처리 발효쌀겨 추출물의 추출특성 53
• 1) 당도, pH 및 색도 53
• 2) 전당, 환원당 및 총 페놀성 화합물 함량 53
• 3) 아미노산 조성 56
• 2. 초고압액화처리 발효쌀겨 추출물의 항산화활성 58
• 1) DPPH radical 소거능 58
• 2) 환원력 60
• 3) 지질과산화 억제능 61
• 3. 초고압액화처리 발효쌀겨 추출물의 효소활성 저해효과 62
• 1) Tyrosinase 저해활성 62
• 2) Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해활성 64
• 요약 66
• Abstract 69
• 참고문헌 72