Effects of Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor on Prevention of Aminoglycoside Induced Sensory Hearing Loss : 아미노글라이코사이드 항생제에 의한 이독성에 미치는 Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor의 효과

박기호 Kosin University Graduate School 2003 국내박사

연구배경 및 목적 : Glial cell-lined Derived Neurotrophic Factor (GDNF)는 소음이나 약물 같은 외부의 스트레스에 의해 야기되는 유모세포의 변성정도를 방지하거나 줄일 수 있는 여러 성장인자 중 하나로 알려져 있다. 이 연구의 목적은 임상적으로 고막을 통해 내이로 약물을 투여할 수 있는 유일한 방법인 정원창을 통해 GDNF를 투여하여 내이로의 투과성을 조사, 임상적인 투여경로를 확인하고 더 나아가 정원창을 통해 투여된 GDNF가 아미노글라이코사이드 항생제의 이독성을 방지할 수 있는 가를 알아보고자 하였다. 연구대상 및 방법 : 무게 250-350g의 기니픽을 사용하였고 실험에 앞서 4, 10,와 20khz에서 뇌간유발반응을 이용한 청력검사를 실시하여 정상 청력을 가진 기니픽을 선발하여 좌측에 미니삼투압펌프를 이식하였고 우측 이는 비교집단으로 사용하였다. 정원창 투과성 실험에서는 기니픽의 좌측 이에 유양동을 개방하여 정원창에 cannula를 위치시키는 이식을 시행한 후 각각 다른 농도의 GDNF (100ng/ml, 500ng/ml, 10㎍/ml, 50㎍/ml, and 1㎍/ml)를 pump에 채우고 이식 후 3일과 9일에 외림프액을 채취하였다. 각각의 샘플은 GDNF에 대한 Monoclonal antibody를 이용한 enzyme-linked immunosorbent asssay (ELISA) 방법에 의해 농도를 측정하였다. 유모세포 보호실험에서는 정원창 투과성 실험과 마찬가지로 기니픽의 좌측 정원창에 배관을 위치시키는 미니 삼투압펌프의 이식수술을 시행하였고 동물그룹을 약물의 종류와 이독성 실험의 종류에 따라 5가지 그룹으로 분류하여 각각을 비교하였다 . 그룹 Ⅰ, Ⅲ,과 Ⅴ 에는 1mg/ml농도의 GDNF를 펌프에 채워 이식하였고 그룹 Ⅱ, 와 Ⅳ에는 인공 외림프액을 채워 이식하였다. 그룹 Ⅰ과 Ⅱ는 매일 120mg/kg의 겐타마이신을 펌프 이식 후 3일에 시작하여 19일 동안 연속하여 매일 피하 주사하였고, 그룹 Ⅲ와 Ⅳ는 펌프 이식 후 3일째 카나마이신(150mg/kg)과 에사크리닉산(40mg/kg)을 조합하여 각각 피하 및 정맥을 통해 일회 주사하였다. 그룹 Ⅴ는 이독성 조작을 하지 않고 펌프만 이식하였다. 미니 삼투압펌프는 모든 그룹에서 13일에 교체하였고 모든 기니픽은 펌프 이식 후 26일에 안락사 하여 펌프를 제거하고 펌프의 이상을 검사한 후 와우를 채취하였다. 각각의 동물은 펌프 이식 전날과 펌프 교체일 (13일째)과 안락사 당일(26일째) 에 뇌간유발반응검사를 4, 10,과 20kHz에서 실시하여 청력을 검사하였고 안락사 후 와우를 따로 분리해 와우도로 제작하여 내유모세포와 외유모세포의 변성정도를 퍼센트로 측정하였다. 결과 : 정원창 투과 실험에서는 50mg/ml이하의 농도에서는 3일과 9일 모두 외림프액에서 GDNF를 발견할수 없었으나 그 이상의 농도에서는 정원창을 통과하여 외림프액에서 다양한 농도로 발견되었다. 뇌간유발반응검사에서는 카나마이신과 에사크리닉산을 투여 받은 동물에서는 청력손실의 정도가 너무 심해 GDNF 투여군과 비교군사이의 차이를 발견할 수 없었다. 하지만 겐타마이신을 투여 받은 동물에서는 GDNF 투여군이 통계학적으로 유의한 차이로 좋은 청력을 유지하였다. 안락사후 실시한 와우도 에서도 뇌간유발반응검사에 상응하는 결과를 보였다. 결론 : GDNF는 일정농도이상에서 정원창을 통과하여 외림프액으로 침투할 수 있었으며 카나마이신과 에사크리릭산을 투여하여 나타나는 급격하고 심한 이독성을 예방하지는 못했지만 겐타마이신에 의한 서서히 진행하는 이독성에 대하여는 예방 효과가 있는 것으로 사료된다. Background : Several growth factors including glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) may protect neural elements of the inner ear following hair cell degeneration from environmental stress such as noise and drugs. This study is designed to evaluate the efficacy of exogenous GDNF delivered onto the round window (RW) membrane to protect hair cells from drug induced destruction. Methods : we evaluated GDNF permeability of the RW membrane. Different concentrations of GDNF (100 ng/ml to 1 mg/ml) were delivered onto the RW membrane via osmotic pump (0.5 μl/hr) and assessed by ELISA in 1μl of perilymph sample following 3 day and 9 day of application. GDNF of high concentration (1 mg/ml) penetrated the RW membrane into the perilymphatic space. Then we extended our study to evaluate the efficacy of GDNF to protect hair cells from ototoxic damage caused by a combination of kanamycin (SQ 150mg/kg) and ethacrynic acid (Ⅳ 40mg/kg), and systemic daily gentamicin (SQ 120mg/kg, 19 consecutive days). Auditory evoked brain stem response (ABR) were measured to evaluate threshold shift. At the time of euthanizing animals, cytocochleagrams were prepared. Results : None of animals implanted with concentration of less than 50 μg/ml demonstrated any detectable GDNF in perilymph. In more than 50 μg/ml, GDNF was detected in the perilymphatic space. In the auditory evoked brain stem response (ABR) data, Animals receiving the combination of kanamycin and ethacrynic acid showed severe hearing loss. there were no significant differences between the GDNF treated and untreated ear. However, Animals receiving gentamicin showed progressive hearing loss. there were significant differences between the GDNF treated and untreated ear. In cytocochleagram examed after euthanizing animals, results supported these electrophysiologic findings. Conclusion : The ABR data suggested that GDNF attenuated progressive sensory hearing loss induced by systemic gentamicin and cytocochleagram results supported these electrophysiologic findings. However, it was not effective in preventing the acute sudden hearing loss induced by a combination of kanamycin and ethacrynic acid.

The Role of Decompressive Craniectomy in the Development of Shunt-Dependent Hydrocephalus : 감압성 두개골 절제수술이 뇌수두증의 발생에 미치는 역할

승원배 Kosin University Graduate School 2004 국내박사

목 적 : 감압성 두개골 절제술은 두개강 내 병소로 인하여 두개강 내압이 지나치게 항진하여 생명에 지장이 있을 때 흔히 사용된다. 외상 후 발생하는 뇌수두증은 감압성 두개골절제술과 연관이 있다고 알려져 있으나, 혈관 및 종양질환 수술 후 뇌수두증과 감압성 두개골 절제술과의 관계는 분명하지 않다. 본 연구는 외상을 포함하여 혈관 및 종양질환 수술 후 감압성 두개골 절제술이 실제 뇌수두증의 발생에 기여하는지 알아보고자 한다. 대상 및 방법 : 1997년부터 2001년 사이에 본원에서 수술 받았던 환자, 1264명을 대상으로 후향적 분석을 하였다. 종양, 동맥류 및 외상별로 뇌수두증의 발생빈도와 감압성 두개골 절제수술 후의 뇌수두증 발생빈도를 통계학적으로 비교 하였다. 결 과 : 외상으로 수술하였던 환자는 359명중 10명(2.7%)이 뇌수두증이 발생하였으며, 외상후 감압성 두개골절제술 받은 환자 33명중 6명(18%)이 뇌수두증이 발생하였다.(p<0.001) 동맥류로 수술받은 환자 347명중 단락수술을 받은 환자는 24명(6.9%)이었으며, 이중 감압성 두개골 절제수술 받은 환자 11명중 7명(63.6%)이 뇌수두증이 발생하였다. (p<0.01) 뇌종양 수술 받은 환자 558명중 9명(1.6%), 감압성 두개골 수술 받은 환자 7명중 3명(42.8%)이 뇌수두증이 발생하였다(p<0.01). 결 론 : 감압성 두개골 절제수술은 뇌수두증을 직접 유발하지는 않지만, 그 발생에 기여한다. 두피함몰과 뇌척수액 순환의 장애가 뇌실확장에 기여하는 인자라고 판단된다. 그러므로, 감압성 두개골 절제수술을 할 때, 수술 후 뇌수두증의 발생가능성을 고려하여 신중하게 판단하여야 할 것으로 생각된다. Objective : Decompressive craniectomy is well known method surgical treatment for excessive intracranial pressure increasement by intracerebral lesion. It has been reported that craniectomy after head trauma contributes to the development of hydrocephalus. But, there are no reports about it's role in intracranlal aneurysm and brain tumor. This study is designed to evaluate the role of decompressive craniectomy in the development of hydrocephalus in trauma, aneurysm, and tumor surgery. Methods : Clinical retrospective study of trauma, aneurysm, and tumor patients, a total of 1264, was performed with chart review between Jan. 1997 and Dec. 2001. The incidence of shunt dependent hydrocephalus was evaluated in trauma, aneurysm, and tumor patients with or without decompressive craniectomy, and analysed it with statistical methods. Results : Shunt-dependent hydrocephalus was developed in 10 (2.7%) of 359 patients with trauma, 24 (6.9%) of 347 with subarachnoid hemorrhage by aneurysmal rupture, and 9 (1.6%) of 558 with brain tumor. After decompressive craniectomy, it was developed in 6 (18%) of 33 patientf (p<0.01), 7 (63.0%) of 11 (p<0.01), and 3 (42.8%) of 7 (p<0.01), respectively. Conclusion : Decompressive craniectomy act as a facilitating factor, not a causing. in the development of shunt-dependent hydrocephalus. Scalp sagging and hydrodynamlc change of cerebrospinal fluid circulation may play a primary role. The decilion of craniectomy should include the possibility of hydrocephalus.

Effects of Cadmium on Renal Concentrating Ability and Water Channels : 카드뮴 중독 시 신장의 요 농축능 및 수분 통로의 변화

구순본 Kosin University Graduate School 2004 국내박사

연구 배경 및 목적 : 카드뮴 중독 시 나타나는 신장 기능의 변화로 당뇨, 아미노산뇨, 고인산뇨, 중탄산뇨, 단백뇨, 다뇨, 저장뇨 등이 알려져 있는데 본 연구에서는 다뇨 및 저장뇨의 발생 기전을 밝히기 위하여 카드뮴 만성 중독을 일으킨 쥐에서 신장의 요 농축능을 결정하는 Na^(+) 운반체 및 수분 통로의 발현을 조사하였다. 연구 대상 및 방법 : 실험 동물로 Sprague-Dawley계 흰쥐를 사용하여 CdCl_(2)를 2mg Cd/kg/day 용량으로 4주간 피하 주사하여 카드뮴 중독을 유발한 다음 대사 케이지를 이용하여 요를 채취하고 신 피질 및 외측 수질과 내측 수질 조직을 분리하여 Na^(+)과 K^(+)의 함량을 조사하고, 신장 막 성분에서 Na^(+) 운반체 및 수분 통로 단백질의 발현을 각 단백질의 항체를 이용하여 immunoblot 방법으로 조사하였다. 결과 : 4주간 카드뮴 처치한 쥐에서는 요량 증가 및 요 삼투질 농도의 감소가 일어나 카드뮴 신 중독의 전형적인 특징을 보였다. 그러나 신 피질 및 수질 조직의 Na^(+)과 K^(+) 농도는 대조군과 별 차이가 없어 피질-수질간의 Na^(+) 농도 경사에는 변화가 없음을 나타내었다. Immunoblot 실험에서 근위세뇨관의 Na^(+) 운반체인 Na^(+)/H^(+) exchanger-3(NHE3) 및 수분 통로인 aquaporin-1(AQP1)의 발현은 대조군에 비해 감소하였으나 헨레고리 상행각의 Na^(+) 운반체인 Na^(+)-K^(+)-2Cl^(-) cotransporter(BSC1), 원위세뇨관 및 집합관의 Na^(+) 통로인 epithelial Na^(+) channel의 alpha subunit(α-ENaC) 및 집합관의 수분 통로인 aquaporin-2(AQP2)의 발현에는 큰 차이가 없었다. 결론 : 이상의 결과로 미루어 볼 때 카드뮴 중독 시 신장의 요 농축 기전인 역류증폭계 및 항이뇨호르몬(ADH)-의존성 수분 통로의 발현에는 손상이 없는 것으로 생각되며, 따라서 카드뮴에 의한 다뇨 및 저장뇨는 집합관의 자유수 재흡수가 감소되기 때문이 아니라 근위세뇨관의 Na^(+)-의존성 운반체들의 손상으로 인한 용질 재흡수의 감소에 따라 이차적으로 나타나는 삼투성이뇨의 결과로 생각된다. Background: Chronic exposure to cadmium (Cd) induces renal functional defects characterized by glucosuria, aminoaciduria, phosphaturia, bicarbonaturia, proteinuria, polyuria and hyposthenuria. This study was undertaken to explore the mechanisms of Cd-induced polyuria and hyposthenuria. Renal expressions of Na^(+) and water transporters associated with urine concentrating ability were measured in Cd-intoxicated rats. Methods: In adult male Sprague-Dawley rats, Cd intoxication was induced by subcutaneous injections of CdCl_(2)(2 mg Cd/kg/day) for 4 weeks. Urine was collected in metabolic cages, and renal cortical, outer and inner medullary tissues were analyzed for Na^(+) and K^(+) contents. The abundances of Na^(+) and water transporters in whole kidney membrane preparations were determined by immunoblot using specific antibodies to the transporters. Results: Rats exposed to Cd for 4 weeks showed a distinct polyuria and hyposthenuria, characteristics of chronic Cd intoxication. The renal tissue contents of Na^(+) and K^(+) were not significantly different from the control, implying that the cortico-medullary Na^(+) gradient was not altered by Cd intoxication. Abundances of proximal tubular Na^(+) transporter Na^(+)/H^(+) exchanger-3 (NHE3) and water channel aquaporin-1 (AQP1) were markedly attenuated, but those of ascending Henle's loop Na^(+) transporter Na^(+)-K^(+)-2Cl^(-) cotransporter (NKCC2 or BSC1), distal nephron Na^(+) transporter epithelial Na^(+) channel alpha subunit (α-ENaC) and collecting duct water channel aquaporin-2 (AQP2) were not significantly altered. Conclusion: These results indicate that the Cd intoxication did not impair the countercurrent multiplication system and the ADH-dependent water channels, the two most important factors determining the renal concentrating ability. This, in turn, suggest that the polyuria and hyposthenuria observed in Cd-intoxicated animals were not due to an alteration in free water reabsorption, but to an osmotic diuresis associated with impaired Na^(+)-dependent solute transports in the renal proximal tubule.

Induction of Heme Oxygenase-1 Expression by Rapamycin and Paclitaxel in Smooth Muscle and Endothelial Cells of Human and Rat : Rapamycin과 Paclitaxel에 의한 사람과 백서의 평활근세포와 내포세포에서 Heme oxygenase-1의 발현유도

박철보 Kosin University Graduate School 2004 국내박사

연구배경 및 목적 : Rapamycin과 paclitaxel은 둘다 혈관상피와 평활근세포의 증식을 막기위한 drug-eluting stent에 사용되어 진다. Heme oxygenase-1(HO-1)은 vascular cell에 대해 항증식성으로 알려져있다. 저자는 rapamycin, paclitaxel과 HO-1 사이에 상호작용이 있는가에 대해 평가해 보고, HO-1의 chemical inhibitor인 tin protoporphyrin을 사용해서 paclitaxel의 platelet-derived growth factor(PDGF)에 의한 증식억제와 tumor necrosis factor(TNF)에 의한 세포독성억제작용이 HO-1에 의해 매개되는 지에 대해 규명하고자 하였다. 연구대상 및 방법 : 흰쥐 평활근세포와 사람 폐동맥의 상피세포 배양액 속에 rapamycin과 paclitaxel 투여후 세포의 증식이 증가 혹은 감소되었는지를 liquid scintillation counter를 이용하여 측정한다. 또한 rapamycin이나 paclitaxel이 평활근세포에서 HO-1의 발현에 미치는 영향을 알기 위해서 두 약제가 처리된 평활근세포를 취하여 HO-1의 억제제인 zinc protoporphyrin 투여후 paclitaxel의 항증식성이 소실되는지를 관찰하고, TNF-α-mediated apoptosis가 줄어드는지를 확인한다. 증식과 대사의 활성도는 tetrazoliumbased assay XTT를 이용해 측정한다. 결과 : Rapamycin은 흰쥐 혈관세포와 사람 상피세포에서 HO-1 단백질의 발현을 야기 시킨다. Paclitaxel은 흰쥐 혈관세포와 사람 상피세포에서 농도에 비례하게 HO-1 enzyme activity를 증가시켰다. 10nM의 paclitaxel 투여후 HO-1 protein발현은 12시간 때에 최고치에 다다른다. PDGF에 의한 증식효과는 paclitaxel 투여후 소실되었고, HO-1억제제인 SnPP 투여시에 증식이 관찰되었다. TNF-α로 인해 저하된 세포생존률은 paclitaxel 투여후 늘어났고, SnPP 투여시 떨어졌다. HO-1에 의한 heme의 대사산물인 CO를 없애는 Hb 투여시 pacltaxel의 세포보호기능은 없어졌다. 결론 : Rapamycin과 paclitaxel투여후 HO-1의 발현이 유도되고, 항증식작용과 세포보호작용이 나타나며, 이 작용이 HO-1억제제인 SnPP에 의해 차단되는 것으로 보아 rapamycin과 paclitaxel의 효과가 아마 적어도 부분적으로는 HO-1에 의해 조절될 것으로 보여진다. Purpose: Both rapamycin and paclitaxel are currently being used in drugeluting stent to block the proliferation of vascular endothelial and smooth muscle cells. Heme oxygenase-1(HO-1) has also known to be antiproliferative against vascular cells. In this study, it focused on the role of HO-1 in cytoprotection and antiproliferation of paclitaxel. Materials and Methods: Proliferation of cells and metabolic activity of HO-1 were evaluated with the tetrazolium based assay XTT(Boehringer Mannheim). HO-1 protein expression was shown by western blot analysis of vascular smooth muscle cells(VSMCs), or endothelial cells(ECs), using anti-HO-1 polyclonal antibody from untreated cells and cells exposed to rapamycin and paclitaxel. To determine whether the inhibition of paclitaxel on platelet-derived growth factor(PDGF)-dependent proliferation may be mediated by its induction of HO-1, we exposed cells to paclitaxel, PDGF and SnPP, an inhibitor of HO activity. Percent survival rate was checked to find the anti-apoptotic effect of paclitaxel against tumor necrosis factor(TNF-α)-mediated apoptosis, in the presence or abscence of SnPP. Result: Rapamycin induces HO-1 protein in rat VSMCs and human ECs. Exposure of VSMCs to paclitaxel for 12h resulted in a dose-dependent increase in HO-1 activity. 10 nM of paclitaxel led to a maximal expression of HO-1 protein at 12h after exposure. The addition of SnPP abrogated the supression effect of paclitaxel on PDGF-stimulated cell proliferation, and blocked paclitaxel-mediated supression of TNF-α-mediated apoptosis. Hb, a scavenger of CO, abrogated the paclitaxel induced cytoprotection. Conclusion: Paclitaxel induced the expressin of HO-1 gene in rat VSMCs and human ECs, in dose-dependent and time-dependent manner, like rapamycin.

TRANSFORMATIVE CAPACITY OF THE EDUCATIONAL FUNCTION OF MASS MEDIA IN CONTEMPORARY KENYAN SOCIETY : 현대 케냐 사회에서 대중매체의 교육적 기능이 가지고 있는 사회변화 능력

Benson K. Kamary Kosin University, Graduate School 2010 국내석사

TRANSFORMATIVE CAPACITY OF THE EDUCATIONAL FUNCTION OF MASS MEDIA IN CONTEMPORARY KENYAN SOCIETY Department of Christian Education Kosin University Graduate School Abstract Mass media institution through its educational function has had a significant influence in Kenya since the colonial period. The impact of mass media in shaping the contemporary worldview particularly of economic rationalism and commodification has led to transformation in the society. The influence of mass media is especially profound because human beings are fundamentally creatures of habit and the media is mostly habitually repetitive, unreflecting routine. Marshall McLuhan coined the phrase ?the medium is the message? to refer to the influence of mass media like television and its ability to convey the same message instantaneously in sound and vision to millions of people at the same time than in the particular messages conveyed by specific programs. The message is not restricted to the content and programming. The theme of this paper is built on the premise that there is no neutrality in mass media contents. The media acts as a tool through which philosophical ideas and principles are reflected, disseminated and taught often at a pre-suppositional level. Since these philosophical ideas and principles are so powerful and do not simply develop under spontaneous historical, social, and cultural influences but are products of fundamental and directing commitment which lies at the very core of humankind, they should be subjected to an authentic critique. Media industry in Kenya has also had an outstanding degree of trust from the populace in the recent times. However, beneath this fa?ade lie fundamental needs for a critical awareness of the ways media shapes worldviews in the society. This critical awareness has to begin not with the content of the mass media, but with the ubiquitous nature of the media in itself. For a long time the critique of the fundamental educational function of media, has been unjustly neglected largely because of the commonly accepted perception of mass media content as neutral ? as speaking for the good of the common man, rather than reflecting the worldview commitment of media barons and their supporters or reflecting the cravings of a gullible society, or the expansionist profit-driven ambitions of producers intent on increasing their market share. The media professionals: writers; musicians; producers and journalists make and remake songs, stories, dramas and news items that selectively embody and frame the myths, issues, conflicts and ideals of the existing culture. Naively, most consumers of the media accept this selective interpretation of reality without much questioning since it appears attractive and entertaining. The mass media tend to reinforce and reflect the culture's dominant social, political and cultural assumptions. But because there is no neutrality in media, as in all of life, mass media should be subjected to a reflection, a critique and authentic responses. The subject of non-neutrality will be discussed further in the thesis. A realization of how much perception of the world is filtered through the media screen leads to aspirations for alternative ways of being and seeing the world. Once the illusion that the mass media offers us an objective, transparent view of reality is exposed for the lie that it is, numerous questions arise irrespective of what the particular media arrangements are within the culture. These may be questions about the ideological or political bias of news and documentaries; questions about the media portrayal of social, cultural and tribal alliances, questions about the values and attitudes presented through popular dramas, films and comedy shows, questions about the ownership, the control and organization of broadcasting or the press, and questions about the possibilities for minority points of view to be expressed. A critical engagement in mass media?s educational function, complex as it may seem, requires a shift from blind conviction to systematic analysis of all that technologically advanced mass media has to offer including its promise of a better future in an appeal to novelty and material acquisition as the keys to fulfillment. But the critical analysis, though useful and necessary, is inadequate if it only develops skeptical media consumers and the government operatives. Instead, critical analysis should also generate informed, critical appreciation because developing a critical awareness of the mass media milieu and mass media content deepens the perception of media culture. Furthermore, it encourages people to be better communicators, able to reflect on the communication process itself and mediate the influence of the media on how they think and live. Therefore, mass media, from an authentic worldview perspective as it recognizes its own biases, should function as a light to expose the impact of worldviews on culture and cultural formation. In the current Kenyan context, the media should pay particular attention to the forces of economic rationalism and begin equipping the populace to be aware of its powerful impact on their lives. The application of mass media?s educational function from an authentic worldview perspective in political leadership, education and the church is essential.

Neuritogenetic and Neuroprotective Effects of Berberine : Berberine의 신경세포성장과 신경보호작용

권지윤 Kosin University Graduate School 2003 국내박사

연구배경: Berberine은 많은 약용식물에 존재하는 알카로이드의 하나로서 수천년 동안 동양의학에서 항균 및 항염증제로 널리 쓰여왔다. 최근 들어서는 berberine의 면역증강, 부정맥조절 및 신장보호 기능 등의 약리작용이 연구되어 있다. 그러나 아직 뇌신경계통에 대한 berberine의 약리작용이 알려져 있지 않은 터에 본 연구에서 최초로 berberine의 신경세포성장 작용을 검색하였고, 또한 글루타메이트성(glutamatergic) 신경상해 모델을 이용하여 berberine의 신경보호기능을 관찰하였다. 재료 및 방법: PC12 세포는 미분화노르아드레날린-분비 신경세포 전구세포주로서, NGF (nerve growth factor)의 존재 하에서 아드레날린-분비 신경세포로 분화 성숙하게 된다. 본 연구에서는 PC12 세포주에 berberine을 투여하여 약 4주간 배양하면서 신경세포돌기 성장(neurite outgrowth)현상과 그 정도를 NGF로 분화된 대조군과 비교·관찰하였다. 또한, 생후 7일 이내의 어린 백서에게 (+)MK801을 투여하여 신경상해를 일으킨 신경상해동물모델을 이용하여 berberine의 신경세포보호기능을 조사하였다. 각 실험군의 뇌조직 절편을 제작하고 그 조직절편에서 TUNEL기법을 이용하여 고사신경세포를 관찰하고 그 수를 계산하였다. 아울러 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 PC12 세포에서 NGF mRNA의 발현정도를 관찰하였고, berberine의 신경세포 보호기능을 대표적 항고사 유전자인 bcl-2 mRNA의 발현 양상으로 검증하였다. 결과: Berberine은 PC12 세포에서 NGF와 유사한 정도로 신경세포 축색돌기(axon) 및 수상돌기(dendrite)의 성장을 촉진시켰다. 또한, (+)MK801로 유도된 신경상해동물모델에서는 berberine에 의해 신경세포의 사멸이 억제 또는 지연되는 효과가 나타났다. Berberine을 단독 투여한 어린 백서의 뇌에서는 (+)MK801로 신경상해가 유도된 실험군에 비해 TUNEL 검색에서 양성반응을 보이는 고사신경세포를 거의 발견할 수 없었으며, berberine 전처치는 (+)MK801에 의해 일어나는 세포고사를 현저하게 억제하였다. 또한, PC12 세포에서 berberine에 의해 NGF mRNA의 발현이 유도됨을 확인하였고 어린 백서의 뇌에서 berberine 투여에 의하여 주요 항고사(anti-apoptosis) 유전자인 bcl-2 mRNA의 증가를 관찰할 수 있었다. 결론: 본 연구에서 얻어진 결과를 종합해 보면 berberine은 신경세포 성장, 분화 및 생존을 유도하는 신경성장인자의 기능을 갖고 있다는 결과를 얻었다. 또한 최초로 berberine의 신경세포성장과 신경세포 보호작용을 관찰·보고 하였으며 현재로서는 berberine의 뚜렷한 약리 작용기전을 제시할 순 없지만 여러 퇴행성뇌신경질환의 치료에 효과적으로 응용할 수 있다는 결론을 얻었다. Background: Berberine is an alkaloid present in many medicinal herbs, which has been prescribed for infections and inflammatory diseases for several centuries in Oriental traditional medicine. In the present study, novel actions of berberine, neurite outgrowth promoting activity and neuroprotective effect were determined. Methods: PC12 cells were cultured in the presence of different concentrations of berberine to examine the neuritogenetic effect, and nerve growth factor (NGF) was used as a positive control. Four-day-old rats were injected intraperitoneally (ip) with normal saline or berberine for 3-4 days before they were exposed to (+)MK801, which causes massive apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Degenerating neurons were evaluated by TUNEL. NGF mRNA expression was examined in PC12 cells and bcl-2 mRNA expression was determined in pup rat brains. Results: Berberine induced the neuritogenesis, which is comparable to the effect exerted by NGF in PC12 cells. In addition, berberine pretreatment effectively reduced the number of TUNEL-positive apoptotic neurons against (+)MK801-induced excitotoxicity in pup rat brains. Berberine increased NGF mRNA expression in PC12 cells and bcl-2 mRNA expression in pup rat brains. Conclusion: Any molecule that promotes neurite outgrowth, neuronal differentiation and survival both in vitro and in vivo satisfies the definition of neurotrophic factors. According to the data obtained from the present study, berberine has therapeutically beneficial neurotrophic actions that can be utilized in many neurodegenerative diseases. It remains to be determined whether the mechanism of action underlying the observed neuritogenetic and neuroprotective effects of berberine has sufficient specificity and efficacy in appropriate in vivo models. However, this is, to my knowledge, the first report describing the neuritogenetic and neuroprotective effects of berberine.

Relationship Between K_(ATP) Channel Activation and Oxygen Free Radical Generation : ATP-의존성 칼륨통로(ATP-sensitive potassium channel, K_(ATP) channel)의 활성과 산소라디칼 생성 간의 관계에 대한 연구

장윤식 Kosin University Graduate School 2003 국내박사

연구배경 및 목적: 본 연구의 목적은 토끼 심장에서 허혈 전처치의 심장보호기전으로서 널리 알려진 ATP-의존성 칼륨통로 (ATP-sensitive potassium channel, (K_(ATP) channel)의 활성과 산소라디칼 생성 사이의 관계를 규명하고자 하였다. 재료 및 방법: 토끼 심장을 이용하여 절편을 만든 후 산소라디칼 생성의 지표로서 malondialdehyde (MDA)를 측정하였다. 결과: K_(ATP) 통로 개방제인 pinacidil과 cromakalim은 MDA 생성을 현저히 증가시켰으며 그 반응은 농도에 비례하였다. 또한 MDA 생성은 K_(ATP) 통로 개방제의 처리 시간에 비례하여 증가하였다. K_(ATP) 통로 차단제인 glibenclamide와 5-hydroxydecanoate (5-HD)는 K_(ATP) 통로 개방제에 의한 MDA 생성을 농도에 비례하여 감소시켰다. K_(ATP) 통로 개방제로 전처치한 심장 절편에 Fe^(2+) 를 투여한 군은 Fe^(2+) 만 단독으로 투여한 군에 비해서 MDA 생성이 현저히 증가하였다. Fe^(2+) 농도와 MDA 생성사이에 양의 상관관계를 나타냈다. 15 분 동안의 저산소증 환경에서 심장 절편의 MDA 생성은 산소를 재투여하기 전까지 별다른 변화를 보이지 않았으나 30분동안 산소를 투여했을때 MDA 생성이 현저히 증가하였다. 그러나 glibenclamide나 5-HD를 첨가했을때는 저산소증 후 산소 재투여에도 MDA 생성을 증가시키지 않았다. 결론: 토끼 심장 절편 실험에서 미토콘드리아에 존재하는 K_(ATP) 통로의 활성은 Fenton-type 반응을 통해 산소라디칼의 생성을 증가시키는 것으로 사료된다. Background: The purpose of this study was to determine whether ATP-sensitive potassium channel (K_(ATP) channel) activation generates oxygen free radicals in the rabbit heart. Materials and Methods: We assayed malondialdehyde (MDA) in rabbit heart slices in vitro as an indicator of oxygen free radical generation. Results: The K_(ATP) channel openers, pinacidil and cromakalim, significantly increased MDA production in a concentration-dependent manner. MDA formation also increased linearly with incubation time in the presence of K_(ATP) channel openers. The K_(ATP) channel blockers, glibenclamide and 5-hydroxydecanoate (5-HD), decreased K_(ATP) channel opener-induced MDA formation in a concentration-dependent manner. When Fe^(2+) was administered to heart slices that had been pretreated with K_(ATP) channel openers, a marked elevation in MDA was observed, compared to heart slices that were treated with Fe^(2+) alone. A positive linear correlation between Fe^(2+) and MDA level was observed. The MDA levels of heart slices subjected to anoxia for 15 min remained unchanged until reperfusion. When the heart slices were reoxygenated for 30 min, a marked increase in MDA formation was observed. However, in the presence of glibenclamide and 5-HD, reperfusion following anoxia did not result in increased MDA. Conclusion: These results suggest that the opening of mitochondrial K_(ATP) channels in rabbit heart slices evokes oxygen free radical generation via a Fenton-type reaction.

Molecular Characteristics of the Inhibition of Human Neutrophil Elastase by Salicylic Acid : Salicylic acid에 의한 사람 중성구 Elastase 활성도 억제에 관한 분자약리학적 특성

조은석 Kosin University Graduate School 2004 국내박사

연구배경 및 목적: 소염 재는 염증성 질환을 치료하는데 임상적인 효과가 큰 약재로 알려져 있다. 지금까지 알려진 이들 약물의 치료 기전은 cyclooxygenase의 활성도 억제에 의한다고 알려져 있다. 그러나 최근에는 이 기전 하나만으로 작용 기전을 다 설명할 수 없는 많은 다른 사실들이 발견됨에 따라 또 다른 작용기전이 있으리라는 의견이 대두되기 시작하였다. 그 일환으로 사람의 중성 구 elastase가 염증 질환의 원인이 된다는 사실이 알려졌으며 일부 소염제가 elastase의 활성 도를 억제하는 사실도 알게 되었다. 본 연구에서는 소염제 중 Salicylic acid 가 HNElastase의 활성도 억제에 미치는 특성과 그 활성도 억제의 분자약리학적 작용기전을 연구하고 자 한다. 연구 방법: 3전혈로부터 분리한 중성 구를 분쇄한 후 Ultrogel AcA54 gel filtration, CM-Sephadex ion exchange, 그리고 HPLC Chromatography의 3단계 분리과정을 시행하여 순도 높은 HNElastase를 분리하였다. 이들 HNElastases를 이용하여 활성도 억제 시험을 하였다. 결 과: HNElastases의 활성 도는 Salicylic acid에 의하여 농도 의존적으로 억제되었다. 분가 구조의 변화를 보기 위하여 Raman spectrum을 조사한 결과 HNElastase-Salicylic acid-complex는 HNElastases에서는 전혀 나타나지 않았던 678, 710, 950, 1022, 그리고 1423cm^(-1)에 강한 Raman shift 밴드를 보여주었다. 이들 Raman Shift band 들은 Salicylic Acid 분자가 HNElastases 분자와 결합하여 4차원 구조의 변화가 생겼다는 것을 확인할 수 있는 증거이다. Salicylic Acid 분자는 HNElastases분자에 covalent 결합을 하여 활성부위를 덮고 있어 기질의 접근이 불가능하게 만든 것으로 생각된다. 결 론: Salicylic Acid가 HNElastases의 활성부위에 강하게 결합하여 그 활성도를 억제하는 것은 지금까지 알려진 Prostaglandin 합성을 억제하는 기전 이외에 또다른 새로운 작용기전으로 확인되었으며 향후 임상에 적용할 때 치료 제 처방에 중요한 고려할 점이 되리라 예상된다. Nonsteroidal antiinflammatory drugs(NSAIDs) have been known as effective agents for treatment of inflammatory diseases clinically. Inhibition of cyclooxygenase has been thought to be a major facet of the mechanism of NSAIDs. However, It is difficult to explain the antiinflammatory effects of NSAIDs to the inhibition of prostaglandin synthesis solely. Human neutrophil elastase(HNElastase;HNE, EC 3.4.21.37) has also been known as a causative factor of inflammatory diseases. Several nonsteroidal antiinflammatory drugs(NSAIDs) such as phenylbutazone, ibuprofen, aspirin, and salicylic acid effectively inhibited HNElastase. To investigate the specific molecular pharmacological mechanism of action of the HNElastase inhibition by salicylic acid, HNElastase was purified by Ultrogel AcA54 gel filtration, CM-Sephadex ion exchange, and HPLC (with TSK 250 column) chromatography. salicylic acid inhibited HNElastase by concentration dependent manner. HNElastase- salicylic acid -complex showed strong Raman shifts at 678, and weak bands at 710, 950, 1022, and 1423 cm^(-1). Those Raman bands might be an evidence of binding of the salicylic acid to the enzyme molecules and showing the conformational change of the enzyme molecule. Salicylic acid might be covalently bound to the active site of HNElastase, and masked the active site and prevented the binding of substrate to the active site. This inhibition of HNElastase by salicylic acid could be an important mechanism of action in treatment of inflammatory diseases including arthritis beside of cyclooxygenase inhibition. Molecular pharmacological characteristic of inhibition of HNElastase by salicylic acid was unique and showed similar inhibition characteristic to phenylbutazone that showed ionic and hydrophobic interaction between enzyme and drug. Strong inhibition characteristic of HNElastase by NSAID, salicylic acid could be an important point for drawing the criteria for appropriate drugs in clinical application in addition to the consideration of as cyclooxygenase inhibitors.

The Expression of Survivin and SSX Genes in Colorectal Carcinomas : 대장암에서 Survivin과 SSX 유전자의 발현

김민정 Kosin University Graduate School 2004 국내박사

연구배경 및 목적 : 인형 SSX 유전자는 Xp 11에 위치하는 9개의 아형으로 구성된 유전자군으로, 활액막 육종에서 (X:18)전위에 관여한다고 최초로 보고되었다. 유전자의 mRNA는 장상 조직에서는 고환에만 발현되나, 악성 종양에서는 다양한 조직학적 유형에서 발현되므로 암-고환 항원군으로 분류된다. Survivin은 새로이 고사(아포프토시스)-억제 유전자군에 추가된 유전자이다. Survivin 발현이 대장암에서 보고는 되고 있으나, 상이한 결과들로 논란이 많으며, 임상적 의의에 대해서도 불명확하다. 더우기 이들 두 유전자들은 세포자멸사에 관여하므로써 암 치료나 chemoprevention의 표적으로의 가능성이 제기되고 있다. 대장암에서 survivin과 SSX 유전자의 발현을 조사하고 임상 및 예후 인자들과의 관련성을 분석하여 대장암의 발생과 임상 측면에서 이들 유전자의 역할을 이해하고 예방과 치료에 이용할 수 있는 지를 조사하고자 하였다. 연구대상 및 방법 : 다양한 병기의 37예의 신선한 대장암 수술 조직을 대상으로 하였다. 암 조직과 주위 비종양성 조직에서 총(total) mRNA를 분리하여 역전사-연쇄중합효소반응으로 survin과 SSX 유전자의 mRNA를 검출하였다. 특히 SSX 유전자 1-9를 한꺼번에 검출하기 위하여 공통 시발체를 독창적으로 고안하였다. PCR 산물과 SSX의 아혐을 확인하기 위하여 아클로닝후에 DNA 염기 분석을 시행하였다. 결 과 : 대장암에서 SSX의 발현율은 32.4%이었고, 주위 비종양 조직에서는 발현되지 않았다. Survivin의 발현율은 대장암 조직에서는 94.6%였고, 비종양성 조직에서는 51.4%으로, 대장암 조직에서 survivin의 발현이 높았으나, 비종양성 조직에서의 경계성 영역의 유의한 차이가 인정되었다(0.05<p=0.065<0.1). 연령, 성별, 침윤 깊이, 림프절 전이, 혈관과 신경 침범, 간으로의 전이등의 임상및 병리학적 인자들과 두 유전자 발현의 상관성은 없었다. 두 유전자 발현간의 상관성은 없었다. SSX-1,-2,-4,-5는 각각 2(16.7%), 2(16.7%), 5(41.7%), 3(25.0%)예로 SSX-4의 발현빈도가 가장 높았다. 결 론 : survivin은 대장암에서 암특이적으로 발현되지 않았다. SSX는 발현 빈도는 높지 않으나, 암에서만 특이한 발현을 보였다. 이상의 결과로써, 대장암의 치료나 chemoprevention에서 SSX와 survivin의 이용은 가능하나 제한적일 것으로 생각된다. SSX와 survivin 발현의 상관성이 인정되지 않으므로, 대장암에서 SSX은 survivin- 관련 항아포토시스 경로와는 무관할 것으로 생각된다. Background: Human synovial sarcoma on x chromosome(SSX) was first identified as gene involved in the t(X;18) tranlocation in synovial sarcoma. SSX is a multigene family, with 9 complete genes on Xpll Normally, almost exclusively in 4he testis, SSX mRNA is expressed in various human tumors, defining SSX as a cancer/testis antigen. Survivin is a novel member of the inhibitors of apoptosis proteins (IAP) gene family. Although survivin expression has been reported in colon cancer, the reslllts are still controversial and its clinical significance including chernoprevention remains unclear. However, two genes are recognized as a potential target in anticancer therapy. To facilitate understanding of the SSX and its product in the colon cancer, the expression of SSX and its clinical significance was investigated with the expression of survivin. Materials & Methods : Surgical specimen were obtained from a total 37 cases of consecutive patients with various stages of colorectal carcinoma who had undergone a resection. To determine surviuin and SSX mRNA in colorectal carcinomas and adjacent normal colorectal tissue samples, total RNA was isolated from each of the samples after lysis in quanidinium isothiocyanate and phenol extraction and reverse-transcription polymerase chain reaction was done. For the detection of expression of SSX 1-9 together at one time, the common primer sets were designed. The PCR products and isotypes of SSX were confirmed by DNA sequencing after subcloning. Results: The expression rate of SSX were 32.4% (12/37) in colorectal adenocarcinoma, while it was not detected in adjacent normal tissue. The positive rate of survivin in cancer tissue was 94.6% (35/37) and that of non-neoplastic colorectal tissue was 51.4% (19/37). Survivin expression tended to increase in cancer tissue, but has statistically marginal significance (0.05<p=0.065< 0.1). The each correlation of SSX and survivin expressions to age, gender, invasion depth, lymph node metastasis, vessel and perineural invasions, and liver metastasis was not found. The significant relationship between two gene expressions was not identified. The each expression of SSX-1, -2, -4, and -5 was 2, 2, 5, and 3 cases. The SSX-4 showed the highest incidence among them. Conclusion : The expression of survivin appears not to be eligible to differentiate malignant from benign lesions in colon, even though it has marginal significance(0.05<p=0.065< 0.1), whereas the expression of SSX is specific for malignant tumor in colon(p=0.000) although the rate is not high. The role of SSX in survivin-associated apoptosis in colon cancer may be unnoticeable in colorectal carcinomas.

Expression of Hypoxia-inducible Factor-1α in Esophageal Squamous Cell Carcinoma : Relationship to Prognosis and Tumor Biomarkers = 식도 편평세포암에서 Hypoxia-inducible Factor-1α의 발현 : 예후와 종양표지자와의 상관성

양일종 Kosin University Graduate School 2004 국내박사

연구 목적 : 악성종양에서 신생혈관 생성 및 당분해의 증가는 저산소 상태의 미세환경을 나타내며, 이는 종양의 침습성, 전이, 및 환자의 예후와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1)는 당원 수송체, 당분해 효소, 혈관내피세포 성장인자 등의 유전자의 전사를 활성화한다고 알려져 있다. 그리고 HIF-1의 전사 활성도는 HIF-1α subunit의 표현이 조절되는 정도에 의존한다. 그러나 식도암에서 HIF-1의 발현과 혈관 생성능 및 종양세포 증식능과의 관계 및 예후에 관한 연구는 전무하다. 따라서 식도 편평세포암에서 HIF-1α의 역할을 규명하고자 연구를 시행하였다. 연구대상 및 방법 : 고신대학교 의과대학 흉부외과학교실에서 1995년부터 2000년까지 수술치험한 77례의 식도 편평세포암 환자의 조직에서 채취한 정상 편평상피 및 암조직에서 면역조직화학검사를 이용하여 HIF-1α의 발현을 조사하고 혈관생성인자, 증식지수, p53 단백과의 상관관계, 임상-병리학적인 인자 및 생존율과의 상관관계를 분석하였다. 결과 : HIF-1α의 과발현율은 42.9%(33례/77례)였다. HIF-1α의 과발현은 조직학적 등급(p=0.032), 병리학적 병기(p=0.002), 종양 침윤의 깊이(p=0.022), 주위 림프절 전이(p=0.002), 원격전이(p=0.049), 림프관 침윤(p=0.004) 과 관련이 있었다. HIF-1α의 과발현은 혈관내피세포 성장인자의 발현, Ki-67 증식지수와 관련이 있었고, 미세혈관수와는 관련이 없었고, 이상형의 p53의 발현과는 관련이 있는 경향을 보였다. HIF-1α의 과발현을 보이는 환자는 HIF-1α의 발현이 없는 환자보다 불량한 생존곡선을 보였고, 단변량분석과 다변량분석에서 HIF-1α의 과발현은 불량한 예후를 나타내는 인자로 보였다. 결론 : 이상의 결과로 식도 편평세포암 환자에서 HIF-1α의 발현은 종양조직내 신생혈관의 생성과 관련이 있고, 림프절 전이의 지표가 되며, 수술후 불량한 예후를 나타내므로 술후 보강 항암요법등 보다 강화된 치료전략이 필요할 것으로 사료된다. Tissue hypoxia is characteristic of many human malignant neoplasm, and hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) plays a pivotal role in essential adaptive response to hypoxia, and activates a signal pathway for the expression of the hypoxia-regulated genes, resulting in increasing oxygen delivery or facilitating metabolic adaptation to hypoxia. Increased level of HIF-1α has been reported in many human malignancies, but in esophageal squamous cell carcinoma, the influence of HIF-1α on tumor biology, including neovascularization, is not still defined. In present study the influence of HIF-1α expression on angiogenic factors, correlation between the tumor proliferation and HIF-1α expression, interaction of HIF-1α expression and p53, and correlation between HIF-1α expression and clinicopathological prognostic parameters were investigated, using immunohistochemical stains for HIF-1α, VEGF, CD34, p53, and Ki-67 on 77 resected esophageal squamous cell carcinoma. Of 77 cases of esophageal squamous cell carcinoma, 33 cases (42.9%) showed positive stain for HIF-1α. High HIF-1α expression was significantly associated with several pathological parameters, such as histologic grade (p=0.032), pathological TMN stage (p=0.002), the depth of tumor invasion (p=0.022), regional lymph node metastasis (p=0.002), distant metastasis (p=0.049), lymphatic invasion (p=0.004). High HIF-1α expression was also significantly VEGF immunoreactivity (p=0.008) and Ki-67 labeling index (p<0.001), but was not correlated with microvascular density within tumors (p=0.088). The high HIF-1α expression was correlated with aberrant p53 accumulation with a marginal significance (p=0.056). The overall 5-year survival rate was 34.9%. The survival curve of patients with a high HIF-1α expression was worse than that of patients with low-expression tumors (log-rank test, p=0.0001). High HIF-1α expression was independent unfavorable factors although statistical significance is marginal in multivariate analysis. In conclusion, it is suggested that (1) high HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma is associated with tumor hypoxia, or with genetic alteration in early carcinogenesis (early in carcinogenesis) and progressive stages, (2) high HIF-1α expression may be associated with intratumoral neovascularization through HIF-VEGF pathway, and (3) high HIF-1α expression is associated with poor prognosis in patients with esophageal carcinoma and may play a role as biomarker for regional lymph node metastasis.