PtrTALE12, a member of TALE transcription factor family in Populus trichocarpa, is involved in axillary shoot development by regulating WUSCHEL expression

배소영 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

In response to endogenous and/or exogenous stimuli, transcription factor (TF) regulates plant growth and development by modulating the rate of transcription initiation of target genes. Among them, a particular class of TF, the Three-Amino-acid-Loop-Extension (TALE) homeoproteins has been shown to control meristem formation and organ morphogenesis in plants. Poplar, a model woody plant, has a total of 35 TALE transcription factors, which is larger than that of Arabidopsis (22 members). As a first step towards understanding functional role of TALE family in woody perennials, the entire TALE family members of Populus trichocarpa were cloned in overexpression (PtrTALE-OX) and suppression (PtrTALE-SRDX) constructs. To characterize the molecular function of the poplar TALE TF family, we performed a phenotype-based screening of transgenic Arabidopsis populations, which were created by transformation of either overexpression or suppression of the TF gene constructs. As expected, many transgenic Arabidopsis plants showed altered plant architecture, leaf shaping and apical dominance. Among them, the overexpression of PtrTALE12, which seems like ortholog of Arabidopsis BLH11, showed significantly unique phenotype, enhanced axillary shooting. Interestingly, the expression level WUSCHEL(WUS) that is core factor to regulate stem cell population in SAM was significantly increased. Some persuadable proof has been appeared showing its interacting partner is SHOOT MERISTEMLESS(STM), which plays really significant roles in shoot apical meristem. RNA-seq has also provided corresponding result and additional keys to explain the phenotype such as significantly down-regulated circadian rhythm and Jasmonic acid(JA) related genes, which are all related to initiating axillary shoots. We hypothesized that these three factors, which are WUS, circadian rhythm, and JA were regulated by cytokinin level increase, and this resulted in PtrTALE12-OX phenotype. Conclusively, all of these were involved in functional mechanism of PtrTALE12 in plant 포플러의 전체 TALE 전사 인자 (TF) 계열을 연구하기 위해, 33개의 포플러 TALE TF의 발현을 증가시키거나(OX) 기능을 억제하는(SRDX) 벡터를 제작하여 애기장대 형질전환체를 생산하였다. 형질전환 된 애기장대 집단에서 표현형에 기초하여 흥미로운 표현형을 가진 라인들을 선별하였다. 본 연구에서는 axillary shoot이 과도하게 발달하여 덤불 같은 모양을 가지며 키가 작은 표현형이 나타난 PtrTALE12의 과발현체를 통해, 그 기능을 규명하기 위한 목표로 연구를 진행하였다. 먼저, WUS(WUSCHEL)이 유도되면axillary shoot이 발달한다고 보고된 바에 따라, PtrTALE12의 과발현체의 rosette 잎 겨드랑이 부분을 샘플링하여 quantitative RT-PCR 및 RNA-seq을 통해WUS의 발현을 확인한 결과, 표현형의 세기와 일치하게 뚜렷이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 Transient activation assay를 통해 in vivo에서, proWUS::GUS X 35S::PtrTALE12를 통해 in planta에서 또한 검증 되었다. 그리고 TALE TF는 BELL 그룹과 KNOX 그룹에 속하는 멤버들이 서로 단백질 interaction을 한다는 것이 알려져 있기 때문에, BELL 그룹에 속하는 PtrTALE12는 KNOX 그룹의 어떤 멤버와interaction을 하는지 검증한 결과, STM(SHOOT MERISTEMLESS)과 interaction함을 알 수 있었다. 또한, PtrTALE12의 과발현체는 추대가 wild type에 비해 열흘 정도 빠르게 일어나는데, 그것은 CCA1과 LHY라는 circadian gene의 발현이 현저하게 감소했기 때문임을 알게 되었다. 그리고 RNA-seq 결과, JA(jasmonic acid)관련 유전자들이 매우 현저하게 감소해 있음을 알게 되었고, 이 또한 axillary shoot을 발달시키는 것과 관련이 있었다. 또한, PtrTALE12의 과발현체의 표현형을 보면 정단 우세 또한 망가져 있는 것을 알 수 있는데, 이는 auxin의 부족과 관련이 있다고 생각했고 auxin과 그 inhibitor를 추대 직후의 애기장대에 처리함으로써 증명하였다. 따라서, PtrTALE12가 과발현 되면, auxin이 부족해지면서 cytokinin가 늘어나고, 그 결과 WUS의 발현이 증가함과 동시에 JA이 감소하였으며 CCA1과 LHY가 감소하는 요소들이 복합적으로 작용해 axillary shooting을 촉진하였다고 결론을 내리게 되었다. 애기장대의 TALE TF 중 포플러의 PtrTALE12와 계통적으로 가장 유사한 BLH11의 과발현체도 같은 벡터를 이용해 제작하여 그 표현형을 관찰한 결과 유사한 표현형이 나타났다. 또한, 포플러의 PtrTALE12 과발현체를 제작하여 표현형을 분석한 결과, axillary branch수가 뚜렷하게 증가하였고 표현형이 강한 라인의 경우 키가 작아진 것도 관찰하였다. 이로써 PtrTALE12는 잎 겨드랑이에서 하위 유전자들의 발현을 조절함으로써 axillary shoot의 발달을 조절한다는 것을 밝히게 되었다.

substance P enhances mesenchymal stem cells-mediated immune modulation

김은희) 경희대학교 생명공학원 2015 국내석사

Since clinical application of MSCs requires long-term ex vivo culture inducing senescence in MSCs and reducing the therapeutic activity of transplanted MSCs, numerous efforts have been attempted to sustain the active state of MSCs. Substance P (SP) is a neuropeptide that functions to activate the cellular physiological responses of MSCs, including proliferation, migration, and secretion of specific cytokines. In this study, we explored the potential of SP to restore the weakened immune modulating activity of MSCs resulting from long-term culture by measuring T cell activity and interleukin-2 (IL-2) secretion of CD4+ Jurkat leukemic T cells. As the number of cell passages increased, the immunosuppressive function of MSCs based on T cell activity decreased. This weakened activity of MSCs could be restored by SP treatment and nullified by co-treatment of an NK1 receptor blocker. Higher levels of transforming growth factor beta 1 (TGF-1) secretion were noted in the medium of SP-treated late passage MSC cultures, but IL-10 levels did not change. SP-treated MSC-conditioned medium decreased T cell activity and IL-2/IFN-g secretion even in the presence of lipopolysaccharide (LPS) or CD3/CD28 antibodies, both of which were successfully blocked by inhibiting the TGF beta signaling pathway. This stimulatory effect of SP on late passage MSCs was also confirmed in direct cell-cell contact by co-culture of MSCs and T cells. Collectively, our study suggests that SP pretreatment to MSCs may recover the immunosuppressive function of late passage MSCs by potentiating their ability to secrete TGF-1, which can enhance the therapeutic activity of ex vivo expanded MSCs in long-term culture.

Effect of High Hydrostatic Pressure Treatment on Conventional Hydroxypropylation of starch

천의현 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내석사

본 연구에서는 종래의 하이드록시프로필화 조건에 초고압을 병행처리하여 치환도와 pasting 특성에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 일반적인 방법의 (5, 10, 15, 20, 24시간, 45oC) 하이드록시프로필화 ‘Con’그룹과 초고압(400 MPa, 15 분)을 전처리 한 후 하이드록시프로필화를 거친 ‘HHP-Con’그룹, 하이드록시프로필화 이후 초고압처리를 거친 ‘Con-HHP’그룹을 각 조건에 따라 제조하였다. 모든 그룹에서 열처리 시간이 증가할수록 치환도 값이 증가하는 일반적인 하이드록시프로필화 전분의 특징이 나타났다. 그룹간의 치환도 차이는 15시간의 반응에서 가장 큰 차이가 나타났으며, 15HHP-Con은 상대적으로 높은 치환도를 갖고 15Con-HHP는 상대적으로 낮은 치환도를 갖는 것으로 나타났다. 반면, 20시간 이후로는 Con 그룹에 비하여 낮은 치환도 값을 나타내어 초고압의 영향이 크지 않은 것으로 나타났다. 투과율 결과에서는 15Con-HHP는 낮은 치환도를 갖고 있음에도 paste clarity 측정 결과 상대적으로 높은 투과율을 나타내어 치환도와 투과율의 비례적 상관관계와는 상이한 결과가 나타났다. Swelling power와 solubility는 열처리 시간이 증가할수록 증가하는 경향이 나타났으며, 열처리시간이 10 시간 이하일때는 큰 차이가 없었으나, 15시간 이후로 초고압 후처리 그룹에서 높은 값을 나타내었다. RVA Pasting 특성 결과에서는 전반적으로 초고압 후 처리(Con-HHP) 그룹들이 일반 타 그룹에 비하여 낮은 pasting temperature와 높은 break down, peak viscosity를 나타내었다. 이는 하이드록시프로필화 과정에서 hydrophilic하고 bulky한 하이드록시프로필기가 그래뉼 내부의 결합력을 약하게 만들었고, 초고압 처리에 의해 그래뉼의 붕괴현상과 hydration에 의한 침출현상이 촉진되어진 것으로 보인다. 이러한 메커니즘을 통한 치환도와 pasting 특성의 변화는 초고압 처리와 종래의 하이드록시프로필화 변성이 융합된 이중 변성 전분으로서의 식품 산업적 활용이 기대된다. In the present study, corn starch was treated with conventional hydroxypropylation conditions in combination with high hydrostatic pressure (HHP) and the effects of the HHP treatment on physicochemical properties of the starches were examined. A conventional hydroxypropylation (5, 10, 15, 20, 24hours, 45oC) ‘Con’ group, a ‘HHP-Con’ group that underwent a pretreatment by HHP (400 MPa, 15 minutes) followed by hydroxypropylation, and a ‘Con-HHP’ group that underwent hydroxypropylation followed by HHP treatment were made under their respective conditions. The characteristic of conventional hydroxypropylated starch in which the value of the degree of substitution (DS) increases along with reaction time appeared in all the groups. The largest difference in the DS among the groups appeared at reactions for 15 hours. The 15HHP-Con group was shown to have relatively high DS while the 15Con-HHP group was shown to have relatively low DS. On the other hand, when reaction time exceeded 20 hours, the HHP-Con group and the Con-HHP group showed lower DS compared to the Con group indicating that the effects of HHP were not great. Although the 15Con-HHP group had low DS, it showed relatively high transmittance in paste clarity. Swelling power and solubility increased with increasing reaction time. Although there was no big difference when reaction time was not longer than 10 hours, the post HHP treatment (Con-HHP) group showed high values when reaction time exceeded 15 hours. In the results of measurement of RVA pasting properties, the post HHP treatment (Con-HHP) group generally showed lower pasting temperatures, higher break down, and higher peak viscosity compared to other groups. This is considered attributable to the fact that, in the hydroxypropylation process under HHP, the hydrophilic and bulky hydroxypropyl groups weakened the binding forces in the granule, the HHP treatment promoted the collapse of granules and accelerated the leaching of intra-soluble materials. The combining HHP treatment and conventional hydroxypropylation is expected to be utilized in the food industry as a dual modification method of starch.

Rapid electrochemical detection of Escherichia coli O157:H7 through magnetophoresis and iron oxide-based immuno nanocatalyst

김상민 경희대학교 생명공학원 2024 국내석사

Escherichia coli O157:H7 (E.C) is toxic pathogenetic bacteria that causes severe illness. Early detection of E.C is crucial for preventing their outbreaks and spread. Herein, a sensitive and rapid electrochemical detection method through the catalytic activity of iron oxide nanoparticles (IONPs) and magnetophoresis was developed. The dextrin was employed on the surface of IONPs to improve their colloidal stability in solution. To selectively capture the target bacteria, maltose binding protein-Streptococcal protein G (MBP-SPG) with specific affinity towards the Fc portion of antibody and dextrin, respectively, was utilized. The target bacteria were effectively captured by immuno-Dex@IONPs. We utilized that the immuno-Dex@IONPs bound to with target bacteria has relatively faster magnetophoretic mobility compared to the free immuno- Dex@IONPs under external magnetic field. In the separation medium, viscous hyaluronic acid was employed to enhance the fractionation of immuno-Dex@IONPs bound to target bacteria from the dispersed free immuno-IONPs. Bacteria-IONPs complex was moved toward the working electrode which placed on a magnet. On the surface of working electrode, the IONPs as a nanocatalysts reduced the hydrogen peroxide and oxidized thionine. Subsequently, thionine took the electrons from the electrode after being oxidized by IONPs. The redox reaction mediated by IONPs was proportional to the target bacteria concentration and it was monitored through electrical measurement. The limit of detection (LOD) calculated from standard curve was 438 CFU/mL. The rapid and sensitive electrochemical detection, incorporating the magnetophoresis and IONPs-based nanocatalyst, has the potential to broaden its use for on-site bacteria detection in food.

A Salmonella Virulence Protein Regulates mRNA Expression of Hexose Phosphates Transporter

이진섭 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

When salmonella infect host cell, it is phagocytized by host macrophage. Intracellular pathogens, including Salmonella enterica and Mycrobacterium tuberculosis, can survive from macrophage by forming phagosome. In this condition, well-known salmonella virulence protein that called MgtC is expressed. It can bind with salmonella’s own F1Fo ATP synthase, which result in inhibition of ATP synthesis. This control is very important for salmonella, because thereby suppress ATP synthesis, salmonella can maintain its membrane potential from external low pH condition. In this very unfavorable environment, salmonella need something else to overcome. One of the proteins regulated by MgtC is UhpT involved in uptake glucose-6-phosphates. The glucose-6-phosphates is benefit to salmonella because it can be used in glycolysis as an intermediate or support phosphorus to salmonella that is important for them. For this reason, in this study tried to find out how MgtC was involved in the regulation of uhpT. Consequently, I found that uhpT451 isoleucine residue is critical to binding with MgtC. and this 451th residue’s length can have an effect on this binding. Because when MgtC present uhpT expression is upregulated, I expected that it will play a role of positive regulator, but when UhpT can’t bind with MgtC, uhpT mRNA expression is upregulated. This result indicated that MgtC is negative regulator of uhpT and suggested that another protein may be involved in this regulation. By bacterial two hybrid assay, I unveil that the another protein is UhpC and it can bind with UhpT and UhpB also. To confirm that how interact these three proteins each other, I carry out immunoprecipitation, which indicated that the MgtC intervene between UhpT and UhpC. So, in this study I suggested uhpT regulation model at two condition. This control of uhpT expression may propose answer of that how salmonella can survive in macrophage and maintain their virulence. Salmonella enterica serovar Typhimurium이 숙주의 식균작용에 의하여 대식세포 안으로 들어가게 되면, 병원성 단백질로 잘 알려져 있는 MgtC를 발현하게 된다. 이 MgtC는 살모넬라 자신의 ATP 합성효소와 결합하여 ATP합성을 억제하게 되는데, 이는 대식세포의 낮은 산 농도로 인한 과량의 수소 분자의 이동을 억제하여 salmonella 가 낮은 산 농도에서도 견딜 수 있게 해준다. ATP를 합성할 수 없는 이와 같은 상황에서 salmonella가 견디기 위해서는 에너지원을 생성할 수있는 또 다른 방법을 필요로 할 것이다. Salmonella의 MgtC에 의하여 조절 받는 단백질 중 하나는 UhpT인데, 이 단백질은 포도당-6-인산을 수송하는 역할을 한다. 이 포도당-6-인산은 해당과정의 중간산물로써 ATP를 합성하는데 사용될 수 있을뿐더러, salmonella에게 필요한 인산을 제공하는 역할을 수행할 수 있다. 따라서 위와 같이 ATP 합성 효소를 통한 에너지 생성이 억제되어 있는 상태의 salmonella 에게 포도당-6-인산을 수송하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 본 연구에서는 UhpT의 451번 residue가 salmonella의 MgtC와 결합하는데 중요한 역할을 한다는 것과 이 residue의 길이가 중요한 역할을 한다는 사실, 그 리고 UhpT와 MgtC의 결합 여부에 따라, uhpT 유전자의 발현이 조절 받는다는 사실을 알 수 있었다. 흥미로운 점은, MgtC가 UhpT와 결합하지 못할 때, uhpT유전자의 발현이 크게 증가한다는 점인데, 이는 MgtC가 UhpT의 음성 조절자(Negative regulator)로 작용한다는 것을 나타낸다. 이것은 또 다른 단백질이 uhpT 유전자 발현 기작에 참여한다는 것을 의미하게 되는데, 본 연구를 통하여 이 단백질이 UhpC라는 사실을 알게 되었다. 이후 면역 침강 실험을 통하여, UhpT와 MgtC 그리고 UhpC가 서로 밀접하게 결합하고 떨어지면서, uhpT 유전자 조절 기작에 참여한다는 사실을 밝혀냈고, 결론적으로 위 기작의 모델을 구성하고 제안하였다.

A Salmonella Protein regulates Virulence to infect Host Cells

백종현 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

이 연구들은 살모넬라균이 숙주 환경에 효과적으로 반응하고 살아남아 숙주의 감염을 일으키기 위하여 어떻게 자신의 병원성 인자를 조절하는가에 대해 보고하기 위해 디자인되었다. 살모넬라균, 페스트균, 그리고 결핵균을 포함한 병원균들이 다양한 방법으로 병원성 유전자를 발현하고 조절함으로서 숙주세포 내에서 살아남기 위해 노력한다. 하지만 어떻게 병원균들이 자신의 병원성을 조절하고 또 어떻게 숙주의 면역시스템을 파괴하는지는 분자적 관점에서 볼 때 많은 것이 밝혀져 있지 않다. 이러한 병원균-숙주의 상호작용을 연구하는 것은 미생물을 더 잘 이해하고 감염성 질병들을 정복하기 위해 필수적인 것처럼 생각된다. 이 논문에서 나는 병원균과 숙주세포가 어떻게 상호작용하는지에 대한 예시들을 소개한다. 예를 들면 무기질 인의 대사, 병원성 인자인 MgtC의 단백분해 조절, 그리고 데옥시리보 핵산의 메틸화와 핵단백질의 상호작용이 그것이다. These studies were designed to report the how Salmonella regulates own virulence factors to effectively respond to host environments, survives within host cells, leads to host infection in molecular view. Albeit pathogens including Salmonella Typhimurium, Yersinia pestis, and Mycobacterium tuberculosis struggles to survive within host cells by expressing and regulating a variety of virulence genes, how pathogens control own pathogenicity and disrupt host immune system are still uncovered in molecular view. Researching pathogen-host cell interaction is essential for understanding microbes in detail and governing infectious diseases. In these reports, I introduce several examples how pathogen and host interact and how pathogen survive in harsh phagosome environments, for example, activating inorganic phosphate metabolism, proteolytic regulation of MgtC, and interplaying DNA methylation and nucleoproteins.

Bee Venom Alleviates Atopic Dermatitis through the Upregulation of Decay-Accelerating Factor (DAF/CD55)

김예니 경희대학교 생명공학원 2018 국내석사

Complement system is a part of the innate immune system. The final result of complement activation is to clear invading pathogens by forming membrane attack complex (MAC) on their surface. However over-activated complement system contributes to the inflammatory process of Atopic Dermatitis (AD). mRNA and protein levels of Decay Accelerating Factor (CD55) were upregulated by BV. Further studies revealed that the phosphorylation of ERK was associated with upregulation of CD55. Complement dependent cytotoxicity (CDC) assay and bacteria killing assay have shown that BV inactivated complement system. We observed thatatopic mice model induced by DNCB increased the serum level of MAC and C3convertase (C3C). When mice were treated with BVusing bilateral subcutaneous injection, the level of MAC and C3C was decreased in atopic mouse. These results strongly suggested that BV alleviate AD symptom by inhibiting the formation of MAC. 보체계는 선천성 면역 반응 중 하나로 막공격 복합체를 형성하여 외부에서 침입한 세균을 제거하는 기능을 한다. 아토피 환자의 경우 보체계는 과활성화되어 있고, 이는 아토피의 증상을 악화시킬 수 있다. 본 연구에서는 꿀벌에서 분리한 봉독이 보체계 조절 단백질을 조절하여 과활성화 된 면역반응 억제 연구를 보여주고 있다.부식 촉발인자의 운반 RNA와 단백질은 봉독을 처리하였을 때 큰 증가를 보였다. 그리고 ERK의 인산화 억제제 처리를 통해 증가하는 부식 촉발인자에 관련된 것을 알 수 있었다. 보체 의존성 세포 상해작용 실험 결과와 혈청 살균 실험은 봉독의 처리에 의해 보체계의 활성이 억제된 것을 보여주었고 쥐 실험에서 정상그룹과 아토피유발 그룹에서 봉독을 처리한 쥐의 혈청에서 막공격 복합체와 보체 C3 전환효소의 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 연구의 결과들을 종합해 볼 때, 과도하게 발현된 막공격 복합체는 아토피와 직접적인 영향이 있고 봉독은 이를 조절하여 아토피 환자의 치료제로서 사용 가능성을 보여주고 있다.

탄수화물 가수분해효소 처리를 이용한 쌀 가공 부산물의 이화학적 특성 파악

박진우 경희대학교 생명공학원 2011 국내석사

쌀에는 탄수화물, 단백질, 비타민 B, 비타민 E, 피틴산, 이노시톨과 같은 영양소가 포함되어 있다. 쌀이 부작용 없는 고급 영양소임에도 불구하고 현재 쌀 가공 부산물은 동물의 사료로 사용되고 있다. 따라서 이번 연구에서는 상용화된 탄수화물 가수분해효소를 이용하여 쌀 가공 부산물을 가수분해 함으로써 효소 처리 후 남은 침전물의 불용성 단백질, 식이섬유 분획을 증가시키는데 그 목적이 있다. 탄수화물 가수분해 효소로는 Termamyl, Fungamyl, Liquozyme, Promozyme, Celluclast 그리고 Viscozyme. 이상의 여섯가지 효소가 사용되었다. 주박과 탈지미강, 시럽박의 시료를 최적 pH와 최전 온도에서 각 효소와 반응시켰다. 그 결과 아밀로스 분해효소 (Termamyl, Fungamyl, Liquozyme) 반응 후 단백질 함량이 주박에서 272.8 ~ 368.4 mg/g, 탈지미강에서 193.6 ~ 238.1 mg/g 으로 높게 나타났다. 셀룰로스 분해효소 (Celluclast, Viscozyme) 에서는단백질 함량이 낮게 나타났다. pullulanse인 Promozyme 은 가장 낮은 단백질 함량을 보였다. 가장 효과가 컸던 효소는 Liquozyme으로, 효소 처리로 인해 주박의 불용성 단백질 함량이 187.1 mg/g에서 368.4 mg/g 으로 증가하였다. 이번 연구로 인해 쌀 가공 부산물의 탄수화물 분해효소 처리로 인한 가수분해 특성에 대한 자료의 토대를 마련할 수 있었다. Rice contains lots of nutrients such as carbohydrates, proteins, vitamin B, vitamin E, phytic acid and inositol et al. While the rice protein and carbohydrate are regarded as a good source of food in nutrition with its non-allergic characteristics, rice by-product (RBP)’s application in food industry has been limited to animal feed. Therefore, the objective of this study was to increase the amounts of insoluble rice protein and rice dietary fiber in RBP by hydrolyzing remaining carbohydrates in RBP using various commercial carbohydrases. Six commercial carbohydrases (Termamyl, Fungamyl, Liquozyme, Promozyme, Celluclast, and Viscozyme) were used to hydrolyze carbohydrate in RBP. The rice wine meal (RWM), defatted rice bran (DRB) and rice syrup meal(RSM) were hydrolyzed with carbohydrases at each optimum pH and temperature. Amylolytic enzymes (Termamyl, Fungamyl, Liquozyme) showed the highest protein concentration in RWM (272.8 ~ 368.4 mg/g) and DRB (193.6 ~ 238.1 mg/g). Cellulolytic enzymes (Celluclast, and Viscozyme) showed relatively low protein concentration and Promozyme, which has pullulanase activity, showed the lowest protein concentration. Overall, insoluble protein content of RWM increased from 187.1 mg/g to 368.4 mg/g after hydrolyzation with Liquozyme. This study provides the basic information of RBP and its hydrolyzation behavior with various commercial carbohydrases.

Biosynthesis of α-1,2-transglycosylated glycoside using kojibiose phosphorylase from Pyrococcus sp. ST04

김유태 경희대학교 생명공학원 2015 국내석사

Pyrococcus sp. ST04 에서 유래한 kojibiose phosphorylase (EC 2. 4. 1. 230)는 kojibiose와 inorganic phosphate를 반응시켜 β-glucose 1-phosphate (β-G1P)와 α-D-glucose를 분해하는 glycosyl hydrolase (GH) family 65에 속하는 효소이다. 이 효소는 당을 분해하는 능력뿐만 아니라 새로운 당에 glucose를 α-1,2 결합으로 당전이를 유도할 수 있다. 이를 위하여 순수한 β-G1P가 필요한데, 이는 trehalose phosphorylase를 사용하여 대량으로 얻어 낼 수 있다. C. bescii에서 유래한 trehalose phosphorylase로 β-G1P가 대량으로 생산될 수 있는 조건을 탐색하였고, 이를 순수하게 정제해 내었다. 정제된 β-G1P를 donor로 사용하고 acceptor로 β-arbutin과 β-salicin을 사용하여 새로운 당전이 산물을 만들어 내었다. 이들은 α-D-glucopyronosyl-1→2 β-arbutin과 kojibiosyl-1,2 β-arbutin, α-D-glucopyronosyl-1→2 β-salicin, kojibiosyl-1,2 β-salicin이며, NMR 분석을 통하여 구조를 밝혔다. 각각의 산물들은 donor와 acceptor의 비율에 따라 생성물의 degree of polymer값을 선택적으로 생산 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 생성물 중에서 α-D-glucopyronosyl-1→2 β-arbutin는 tyrosinase 저해활성에 대해 연구하였지만 활성은 기존 arbutin 당전이 산물보다 낮았다. Kojibiose phosphorylase (EC 2.4.1.230) is inverting phosphorylase that produces β-glucose 1-phosphate (β-G1P) and α-D-glucose from kojibiose and inorganic phosphate. The reverse reaction of kojibiose phosphorylase was applied to synthesizeα-1,2 glycosidic bond and thereby to form α-1,2 oligomer(s). Kojibiose phosphorylase from Pyrococcus sp. ST04 (PsKP), the most thermostable kojibiose phosphorylase, was employed for the enzymatic reaction. Two phenolic compounds, β-arbutin and β-salicin, were used as model acceptor compounds. β-G1P which was used for donor was enzymatically obtained and purified. Biosynthetic reaction was performed at 80oC and pH 5.0 for 8 hours. In TLC analysis two β-arbutin glycosides and two β-salicin glycosides were found in PsKP reactions. The structures of those compounds were determined to be α-D-glucopyranosyl- 1→2 β-arbutin, kojibiosyl-1,2 β-arbutin, α-D-glucopyronosyl-1→2 β-salicin, and kojibiosyl-1,2 β-salicin by NMR analysis. This result implies that α-1,2 glycosidic bond could be specifically formed on phenolic compounds by PsKP. Finally, the length of PsKP reaction products could be regulated by the ratio of acceptor and donor molecules.

Phenylpropanoid derivatives from the flowers of Spiraea thunbergii Sieb

고정수 경희대학교 생명공학원 한방신소재 2018 국내석사

가는잎조팝나무 (Spiraea thunbergii Siebold, Rosacea)는 한국, 중국, 일본 등 동아시아에 서식하는 관목식물이다. 이 식물은 주로 길가의 가로수나 울타리, 꽃꽃이용등의 관상수 및 조경, 특히 꽃은 개화시기를 앞당겨 웨딩플라워의 용도로 사용되고 있다. 가는잎조팝나무의 꽃을 이용한 추출물로부터 여드름 개선용 화장료 조성물에 대한 특허가 등록되어 있다. 가는잎조팝나무의 성분 연구는 줄기로부터 triterpenoid 화합물 (glutinol, tiliadin), 잎으로부터 phenylpropanoid glycoside 화합물 [1-O-trans-cinnamoyl-β-D-glucopyranose, (E)-spirarin], 꽃으로부터 phenylpropanoid glycoside 화합물 [1-O-(4-coumaroyl)-β-D-glucopyranose, 1-O-(E)-caffeoyl-β-D-glucopyranose] 등 총 6개의 화합물이 분리 및 구조동정 되어져 있다. 하지만 꽃에 대한 연구는 매우 미비한 편이다. 따라서, 가는잎조팝나무의 꽃으로부터 활성성분을 분리하기 위하여 본 연구를 시작하였다. 본 연구에서는 가는잎조팝나무의 꽃을 80% 메탄올을 이용하여 실온에서 추출하였고, 얻어진 추출물을 서로 다른 용매의 극성차이를 이용하여 EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획으로 계통분획을 실시하였다. 이 중 n-BuOH 분획에 대하여 SiO2, ODS 및 Sephadex LH-20 column chromatography를 반복수행하여 6종의 페닐프로파노이드 화합물을 분리 및 정제하였다. 각 화합물은 NMR, IR 및 MS spectrum data를 해석하여 (Z)-caffeic acid methyl ester (1), 1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose (2), 1-O-(3,4-dimethoxy-cinnamoyl)-β-D-glupyranose (3), 1-O-(4-coumaroyl)-β-D-glucopyranose (4), 8'-hydroxypinoresinol 4-O-β-D-glucopyranose (5), (E)-caffeic acid methyl ester (6)로 구조동정 하였다 이들 중 1, 3, 5, 6번 화합물은 가는잎조팝나무의 꽃에서는 이번 연구에서 처음 분리되었다. Spiraea thunbergii (Rosaceae), a representative spring flower, is called “Seol Yu Hwa” because it looks like snow blossom on a willow. S. thunbergii is a deciduous broad-leaf shrub plant, widely distributed in Korea, China, and Japan. It grows up to 1-1.5 m in height and is mainly used as an ornamental or wedding flower. The leaves are spinose, serrulate, altemate, and bright green. The flowers are small, white, and umbel, and bloom in early spring. The fruits are of the follicle type, hairless, and 3 mm in diameter. The roots of this plant have been used in Oriental herbal medicine for the treatment of malaria, and as an antipyretic or an emetic. Some phenylpropanoids, which have been reported as the major constituents of this plant, were synthesized from the amino acids phenylalanine and tyrosine. They consist of a C6-C3 carbon skeleton. A series of hydroxylation, methylation, and dehydration reactions produces several types of phenylpropanoids, which are some of the secondary metabolites widely distributed in plants. These have been reported to show various biological activities, such as antioxidant, anticancer, antiviral, anti-inflammatory, and antibacterial properties. Previous studies on the roots and stems of plants have reported secondary metabolites, such as phenylpropanoids and triterpenes. Nevertheless, very few studies have investigated the chemical constituents and biological properties of S. thunbergii flowers. Therefore, the present study was initiated to isolate and identify the active materials from the flowers of this plant. The flowers of S. thunbergii were extracted with an 80% aqueous MeOH solution and the concentrated extract was partitioned into EtOAc, n-BuOH, and H2O fractions, successively. As a result of repeated SiO2, ODS, and Sephadex LH-20 column chromatographies on the n-BuOH fraction, six phenylpropanoid derivatives (1-6) were isolated. The chemical structures were determined to be (Z)-caffeic acid methyl ester (1), 1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose (2), 1-O-(3,4-dimethoxy cinnamoyl)-β-D-glucopyranose (3), 1-O-(para-coumaroyl)-β-D-glucopyranose (4), 8'-hydroxypinoresinol 4-O-β-D-glucopyranoside (5), and (E)-caffeic acid methyl ester (6) based on various spectroscopic methods, such as infrared (IR), mass spectrometry (MS), one-dimensional nuclear magnetic resonance (1D NMR), and two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D NMR). Compounds 1, 3, 5, and 6 were isolated for the first time from the flowers of S. thunbergii Sieb in this study.