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- 저자 : AFZAL RANA AQEEL (검색결과 1 건)
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AFZAL RANA AQEEL 전남대학교 2024 국내박사
Almost all processes that occur in living organisms, such as DNA replication, gene expression and its regulation, and metabolic reactions, involve the interaction of biomolecules. Among these interactions, various methods are used to measure 'strong' interactions with low dissociation constants (KD), but methods for measuring 'weak' interactions with high KD are relatively insufficient. Among the molecules that make up the organism, there are those with high intracellular concentrations in mM ranges, such as glutathione, ATP, and NAD, and the interaction between these molecules and proteins becomes 'strong' enough to fill all binding sites in the protein, even if the KD is 'weak,' as much as 100 μM. Proteins exhibit intrinsic fluorescence by tryptophan and tyrosine residues. In this study, the interaction between proteins and biomolecules was determined by measuring the change in protein intrinsic fluorescence. Malate dehydrogenase (MDH) was used as a model protein to measure the dissociation constant between MDH and biomolecules. MDH of Escherichia coli did not have tryptophan residues but four tyrosine residues. In the present study, each tyrosine residue was converted to tryptophan to make four mutant MDHs, and the fluorescence properties of each mutant MDH were compared. Dissociation constants of substrate and product NADH, oxaloacetate, NAD, malic acid of MDH were determined and compared with enzyme’s kinetic constants. ATP, ADP, and GTP bound to MDH with higher affinity and inhibited enzyme activity noncompetitively. This study proposes a method that can effectively measure the interaction between proteins and ligands without any chemical modification of proteins or ligands. Fumarase C (FumC) is an enzyme that catalyzes the interconversion of fumarate and malate. In the present study, it was found that FumC of E. coli is a novel DNA-binding protein. The oligonucleotides used in DNA-binding studies of CRP (cAMP receptor protein) and HNS (Histone-like nucleoid structuring protein) were used in this study. The dissociation constants between each oligonucleotide and CRP, HNS, SspA, and FumC were measured by fluorescence spectroscopy. FumC seems to have sequence specificity in the binding between DNAs, FumC bound relatively higher affinity to oligonucleotides specific for HNS. Mutant that lacks the fumC gene from E. coli was prepared, and differences in gene expression between the wild type and mutant were examined. The expression of over 600 genes was doubled or halved, suggesting that FumC might bind to DNA under physiological conditions, affecting gene expression. It is a novel finding that FumC interacts with DNA, and we expect to be able to observe the regulation of gene expression by FumC in E. coli. The present study shows that fluorescence spectroscopy utilizing intrinsic fluorescence of proteins is useful for determining KD between proteins and DNA. DNA 복제, 유전자 발현 및 그 조절, 대사 반응 등 생체 내에서 일어나는 거의 모든 과정은 생체 구성 분자들의 상호작용을 수반한다. 이러한 상호작용 중에서 해리 상수(dissociation constant)가 작은, ‘강한’ 결합의 측정에는 다양한 방법들이 사용되고 있으나, 해리 상수가 큰, ‘약한’ 결합을 측정하기 위한 방법은 상대적으로 미흡한 실정이다. 생체를 구성하고 있는 분자들 중에는, glutathione, ATP, NAD 등 세포 내 농도가 mM 단위로 높게 존재하는 것들이 있고, 이들 분자들과 단백질 사이의 상호 작용은, 그 해리 상수가 100 µM 정도로 ‘약한’ 결합이라 할지라도, 단백질 내 모든 결합 자리에 이들 분자들이 채워져 있을 정도로 ‘강한’ 결합이 된다. 단백질은 트립토판과 티로신 잔기에 의해 고유 형광을 보이며, 본 연구에서는 단백질 고유 형광의 변화를 측정하여 단백질과 생체 분자들 사이의 상호 작용을 측정했다. 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH)를 모델 단백질로 사용하여, MDH와 생체 분자들 사이의 해리 상수를 측정했다. 대장균에서 유래한 MDH에는 트립토판 잔기는 없고 티로신 잔기 4개만 있다. 본 연구에서는 각각의 티로신 잔기를 트립토판 잔기로 변환하는 돌연변이 MDH를 준비하여, 각 돌연변이 MDH의 형광 특성을 비교했다. MDH에 기질 또는 생성물인 NADH, 옥살로아세트산염, NAD, 말산 등의 해리 상수를 결정하고, 효소 동역학 상수와 비교했다. ATP, ADP, GTP가 MDH와 강하게 결합하고 비경쟁적으로 효소 활성을 억제함을 발견했다. 본 연구는, 단백질이나 리간드의 화학적 변형 없이, 단백질과 리간드 사이의 상호 작용을 효과적으로 측정할 수 있는 방법을 제시한다. Fumarase C (FumC)는 fumarate과 malate의 상호 전환을 촉매하는 효소이다. 본 연구에서는 대장균 유래 FumC가 DNA 결합 단백질임을 새롭게 발견했다. cAMP receptor protein (CRP)와 HNS (DNA-binding protein HNS)의 DNA 결합 연구에 사용된 적 있는 oligonucleotide들을 사용했다. 각 oligonucleotide들과 CRP, HNS, SspA, FumC 사이의 해리 상수를 형광 분석법을 측정했다. FumC가 DNA사이의 결합에는 서열 특이성이 있는 것처럼 보이며, FumC는 HNS에 특이적인 oligonucleotide에 상대적으로 더 강하게 결합했다. 대장균에서 fumC 유전자를 없앤 돌연변이체를 준비하고, 야생체와 돌연변이체 사이의 유전자 발현 차이를 조사했다. 600 여 유전자의 발현이 2 배 증가하거나 절반으로 줄어드는 것으로 관찰했으며, 이는 FumC가 생리적인 조전에서 DNA에 결합하여, 유전자 발현에 영향을 줄 수도 있음을 시사한다. FumC가 DNA와 상호 작용한다는 것은 새로운 발견이며, 대장균뿐만 아니라 여러 생물체에서 FumC에 의한 유전자 발현 조절을 관찰할 수 있을 것으로 기대하고 있다. 본 연구는 단백질과 DNA 사이의 해리 상수 측정에는 단백질의 고유 형광을 활용하는 형광분석법이 유용함을 보여준다.
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