해군장병에서 비만에 관한 연구

성훈기 ( Hoon-ki Sung ),도경오 ( Kyung-oh Doh ) 국군의무사령부 2004 대한군진의학학술지 Vol.35 No.1

항산화제가 고압산소에 의한 뇌독성에 미치는 영향

도경오 ( Doh Kyung-oh ),성훈기 ( Sung Hoon-ki ) 국군의무사령부 2004 대한군진의학학술지 Vol.35 No.1

Distribution Patterns of Involucrin in the Stratum Corneum of the Normal and Psoriatic Artificial Skins

송인환(In-Hwan Song),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Yung Kim),성언기(Eon-Ki Sung),이융창(Yungchang Lee),박정현(Jeong-Hyun Park),문용석(Yong-Suk Moon),김홍태(Hong-Tae Kim),장성익(Sung-Ik Chang) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.2

Cornified envelope는 최종분화과정에 있는 각질세포의 형질막 밑에 형성되는 비용해성의 구조로서 involucrin, loricrin, cornifin 등 여러 단백질의 상호연결로 안정화된다. 건선은 염증과 각질세포의 과다증식을 특징으로 하는 만성 피부질환이며 각질층의 involucrin에 대한 면역염색에서 정상 표피와는 차이가 있다. 즉 건선에서는 cornified envelope에 제한되나 정상피부에서는 세포질 전반에 표지된다. 본 실험에서는 건선과 정상 각질세포의 분화양상을 비교하기 위해서 건선병변부와 정상피부의 각질세포를 분리 배양하여 정상 및 건선인공피부를 제작하고 이들의 각질층에서 involucrin에 대한 면역금표지법을 시행하였다. 인공건선피부에서는 얇고 엉성한 각질층이 형성되었으며 표지반응이 아래층에서는 세포질 전반에 걸쳐, 상부층에서는 cornified envelope에 국한된 양상을 보여 생체에서와 유사하였다. 정상인공피부에서는 잘 형성된 중층의 두꺼운 각질층이 관찰되었지만 아래쪽의 대부분 영역에서 이상각화증의 흔적이 보였고 세포질 전반에 분포하는 표지반응을 보였다. 표면쪽의 일부 세포에서 cornified envelope에 집중되는 표지반응을 보였지만 정상인공피부의 두꺼운 각질층을 고려할 때 cornified envelope에 집중되는 경향의 정도는 인공건선피부와 비슷하였다. 결과적으로 장기형 인공배양 모델에서 정상 및 건선 각질세포의 최후 분화에서 involucrin 분포 양상은 차이가 없었다. 결론적으로 정상인공피부에서는 비록 잘 발달된 각질층이 형성되었지만 이들은 cornified envelope의 최종분화과정 까지 는 도달하지 못하는 것으로 보이며 건선피부 각질층에서 보이는 involucrin의 분포양상의 차이는 이들 세포의 특성에 기인한다기 보다는 빠른 세포성장에 기인하는 것으로 판단된다. Cornified envelope is highly insoluble structure formed beneath the plasma membrane during terminal differentiation of keratinocytes and is stabilized by cross linking of various proteins, including involucrin, loricrin, and cornifin. Psoriasis is a chronic skin disease characterizing inflammatory reaction and hyperproliferation of keratinocyte. There are some differences in involucrin immunolabelling in stratum corneum between normal and psoriasis epidermis. Labelling was convergent to cornified envelope in psoriasis skin but throughout cytoplasm in normal skin. To compare terminal differentiation patterns of normal and psoriasis keratinocytes, we reconstructed normal and psoriatic artificial skin by using primary cultured keratinocytes from normal and psoriasis skin and then performed immunogold labelling for involucrin in stratum corneum. Psoriatic artificial skin had thin and poorly organized corneal layer. Immunogold labelling for involucrin revealed same pattern of that in vivo by showing throughout cytoplasm in lower layer but convergent cornified envelope in upper layer. Compared with psoriatic artificial skin, normal artificial skin had well organized and thick stratum corneum. Involucrin labelling was throughout cytoplasm in most of corneal layer but convergent to cornified envelope in some uppermost cells. Even though some cells show convergent pattern in normal artificial skin, absolute number of this pattern was no lesser than in artificial psoriatic skin because of normal artificial skin had thick stratum corneum. This result showed there was no difference in involucrin distribution in terminal differentiation of normal and psoriasis keratinocytes in organotypic culture model. It is concluded that although well organized multiple corneal layers are formed in normal artificial skin, they can not reach to full maturation of cornified envelope, and difference of involucrin localization in cornified envelope of psoriasis epidermis is related with not peculiarities of the cells but rapid growing in vivo.

배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 시험관실험모델

홍정숙(Jeong Sook Hong),성훈기(Hoon Ki Sung),송인환(In Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),지대림(Dae Lim Jee),성언기(Eon Gi Sung) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.3

본 실험은 생체의 특성을 잘 유지할 수 있는 별큰포식세포의 배양법을 확립하고, 배양된 별큰포식세포를 이용하여 간 의 허혈-재관류 과정에서 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 재현할 수 있는 시험관내 실험모델을 제작하여 다음의 결과 를 얻었다. 별큰포식세포의 분리에서 collagenase의 관류, stainless 그물의 통과, Percoll gradient centrifugation 및 세포가 배양용기에 부착하는 시간의 차이를 이용한 분별부착법 등의 일련의 조작으로 90% 이상의 순수한 별큰포식세포를 얻을 수 있었다. 흰쥐 1개의 간에서 1~5×107개의 별큰포식세포를 얻었고, 다른 세포의 과다증식없이 별큰포식세포 배양을 10일 정도 유 지할 수 있었다. 배양된 별큰포식세포의 탐식능력은 배양액에 첨가된 latex beads의 탐식정도로 측정하였는데, 그 수가 한 개에서 수십 개로 다양하였다. 크고 둥근 모양의 별큰포식세포가 많은 latex beads를 탐식하였고 작거나 불규칙한 모양의 세포는 탐식 능력이 떨어져, 생체에서의 별큰포식세포의 다양성에 따른 탐식능력의 차이가 시험관에서도 유지되었다. 배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 처리한 실험군에서는 70.2%의 세포가 latex beads를 탐식하였고 latex beads 를 탐식한 세포들 중 57.5%의 세포가 5개 이상의 latex beads를 탐식하여 대조군의 48.9%와 44.3%에 비교하여 유의한 증 가를 보여 (p⁄0.01), 허혈-재관류 후에 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 직접적으로 설명할 수 있는 결과였다. 결론적으로 본 실험에서 배양된 별큰포식세포는 탐식기능에서 생체의 특성을 잘 유지하였고, 이를 이용한 무산소-산소 재공급 시험관모델은 간의 허혈-재관류 손상에서 별큰포식세포의 역할을 이해하는데 적합한 것으로 생각된다. The aims of this study were to describe a reproducible method for the isolation, purification and primary culture of rat Kupffer cells, and were to develop in vitro system which could provide a tool for the study of ischemia-reperfusion injury. Kupffer cells were isolated following sequential collagenase digestion of the liver by perfusion and enrichment of a nonparenchymal cell fraction by a double-densities gradient centrifugation step using Percoll and were selected by allowing them to adhere to culture vessel for 2 h at 37�C under 5% CO2. The purity of obtained Kupffer cell was about 90% assessed by the phagocytosis of 3 μm latex beads. This method for Kupffer cell isolation resulted in yields of 1~5 ×107 Kupffer cells per liver and Kupffer cells were preserved in maintenance cultures for 10 days. The phagocytic capacity of cultured Kupffer cells was measured according to the amount of latex beads incorporated into the cytoplasm. Larger round Kupffer cells in the culture had higher phagocytic capacity compared with smaller round or irregular shaped Kupffer cells. The different phagocytic capacity of Kupffer cells which was dependent on size and shape in vivo was well preserved during culture. The experimental group of Kupffer cells in culture were sequentially treated with ischemia and reperfusion at 1h and 30 min. The ratio of Kupffer cells having latex beads in their cytoplasm was significantly increased compared with control (p⁄0.01). This result was able to explain the Kupffer cells’ activation after ischemia-reperfusion injury in vivo. In conclusion, Kupffer cells in this culture well resembled the cells in vivo and this in vitro model could provide a valuable tool for the study of Kupffer cells with a key role in pathophysiology of ischemia-reperfusion injury.

Effect of Paclitaxel on the β-actin, Fibronectin, Laminin and Fine Structure in HeLa and L929 Cells

김주영(Joo-Young Kim),류인(Yin Liu),성훈기(Hoon-Ki Sung),박정현(Jeong-Hyun Park),송인환(In-Hwan Song),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.1

Paclitaxel로 처리한 HeLa 및 L929 암세포주에서 생기는 β-actin, fibronectin 및 laminin의 세포질 내 분포의 변화가 형태학적인 변화와는 어떤 연관이 있는지를 알아보기 위해 본 실험을 시행하였다. 이 약제에 의한 세포증식의 조절에 관하여는 MTT 분석을 하였고, 위에서 언급된 세포질 내 단백질들의 변화는 면역세포화학적 방법과 analySIS AUTO로 분석하였다. 세포의 형태적인 변화들은 도립현미경과 투과전자현미경으로 관찰하였다. MTT 분석 결과로는 paclitaxel 1 μM과 10 μM의 농도에서 HeLa 세포는 세포성장이 대조군에 비해 20~80% 억제되었고 L929 세포는 27~44% 억제되었으며, 그 효과는 약제의 용량과 시간에 따라 증가되었다. β-actin, fibronectin 및 laminin의 분포는 핵 주변부에서 강한 반응을 보였던 것이 약제 처리 후 세포질 전체에 고루 분포하면서 약한 반응을 나타냈다. 형태학적인 변화로는 2가지 종류의 세포 모두에서 이질염색질의 증가, 과립형질내세망의 부착리보소체의 떨어짐 및 골지복합체의 절편화를 쉽게 볼 수 있었다. 따라서, paclitaxel에 의한 이들 세포의 성장억제와 형태학적인 변화들은 위의 세가지 종류의 단백질들의 재배열과 그 합성의 감소와 밀접히 연관될 것으로 생각된다. The aim of this investigation was to elucidate the changes in the cytoplasmic distribution of β-actin, fibronectin, and laminin through mainly the morphological changes occurring in HeLa and L929 cancer cell treated with paclitaxel. Whether or not paclitaxel regulates cell proliferation was assessed with MTT assay. Possible influence on the distribution of β-actin, fibronectin, and laminin in these cells was confirmed with immunocytochemistry and analySIS Auto software program. The changes in cell morphology were observed under inverted and electron microscope. The MTT assay showed that 1 μM and 10 μM concentrations of paclitaxel inhibited HeLa cell growth approximately by 20% to 80% and L929 cell by 27% to 44% in a dose- and time-dependent manner. The distribution of these proteins was changed from the condensed around nucleus and strong reaction to the weak throughout cytoplasm. The morphological changes indicated that paclitaxel changes the location or number of protein synthesis apparatus: damages of RERs, Golgi complex, and increase of heterochromatin. These data suggest that the growth inhibition and morphological changes of tumor cells induced by paclitaxel might be modulated by the rearrangement and decreased production of β-actin, fibronectin, and laminin in cytoplasm.

Change in Expression of Keratin and Proto-oncogene Induced by Beta-propiolactone in HaCaT Cell

류음(Yin Liu),성언기(Eon-Gi Sung),송인환(In-Hwan Song),Dongyi Du, 김대광(Dae-Kwang Kim),박정현(Jeong-Hyun Park),성훈기(Hoon-Ki Sung),이융창(Yungchang Lee),김주영(Joo-Young Kim) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.4

사람 각질화 세포주인 HaCaT 세포를 Beta-propiolactone (BPL)으로 처리한 후 형태학적인 변화와 kerain 및 protooncogoen 사이의 관계를 밝히기 위해, keratin (K8, K10, K13)과 proto-oncogene (c-fos, c-jun, c-myc)의 발현 변화를 조사하였다. 다양한 농도 (0, 0.1, 1 μg/ml)의 BPL을 이 세포들에 2시간 또는 6시간 동안 처리하였다. BPL에 의해 다각형 모양의 세포들은 섬유세포형으로 변화하였다. 많은 소엽을 보이는 핵들이 나타났으며, 부착반의 수 는 감소하였다. 면역형광법과 Northern blotting의 결과, 이 약제는 K10 (정상적인 각질화세포의 분화 표지자)의 발현은 감소시켰고, 반면에 K8과 K13 (병적인 상태와 관련된 표지자)의 발현을 증가시켰다. 또한 BPL은 c-fos와 c-jun의 발현은 상향조절 시킨 반면에, c-myc의 발현은 감소시켰다. 유세포분석으로 각각의 keratin 또는 proto-oncogene, 그리고 DNA의 양을 동시에 측정하였는데, K8의 발현이 S-G2-M기에서 급격히 증가되었다. 약제 노출 2시간 이내에서 c-Fos의 경우 S-G2-M기에서 증가되었지만, c-Jun은 S-G2-M기에서 처리시간에 따라 차츰 증가되었다. G0-G1기와 S-G2-M기에서 c-Myc의 발현은 용량 및 시간에 비례하여 억제되었다. 결론적으로 BPL에 의해 유발된 이들 결과들은 형태학적인 변화와 keratin 또는 proto-oncogene들의 발현 사이에 밀접한 연관성을 반영한다. To investigate the relationship between the morphologic changes and the expression of keratin and proto-oncogene induced by Beta-propiolactone (BPL), we assessed on the expression of keratins (K8, K10, K13) and proto-oncogenes (c-fos, c-jun, c-myc) in human HaCaT cell line. The cells were treated with 0, 0.1, 1 μg/ml BPL for 2 or 6 hours. Morphologic studies revealed that BPL changed the cells into fibrocyte-shaped, caused highly lobulated nuclei and reduced desmosomes in their number. Findings of immunofluorescence and Northern blotting indicated that BPL consistently decrease expression of K10 representing a normal differentiation marker of keratinocytes, while increasing expression of K8 and K13 associated with a pathologic differentiation. This reagent also up-regulated expression of cfos and c-jun, and down-regulated expression of c-myc. Together with staining for each keratin or proto-oncogene and DNA content in flow cytometry, BPL increased K8 expression dramatically at S-G2-M phase. The induction of c-Fos at S-G2-M phase appeared within 2 hours, and c-Jun gradually occurred. However, c-Myc was inhibited regardless of phases of cell cycle. In conclusion, these changes caused by BPL demonstrate a close relationship between the morphologic evidence and the altered expression of each keratin and proto-oncogene.

녹차의 에탄올 추출물이 암세포주의 형태학적변화에 마치는 영향

장원태 ( Won Tae Jang ),이효권 ( Hyo Kwon Lee ),김미형 ( Mi Hyung Kim ),류인 ( Yin Liu ),최원경 ( Won Kyung Choi ),성훈기 ( Hoon Ki Sung ),박정현 ( Jeong Hyun Park ) 대한임상검사과학회 2000 대한임상검사과학회지(KJCLS) Vol.32 No.3

Green tea is one of most popular traditional teas in korea. ``The purpose of this study was comparing the effects of ethanol extracts on three kinds of cancer cell lines(HepG2, A549, EATC) according to its concentration and exposure time. For this purpose, we obseπed morphological changes under inverted and electron microscope and anallysed cytotoxicity . EATC(Ehrlich-Lettre Ascites Tumor Cell) cells were damaged by 100μg/m1 ethanol extracts treatment until 72 hours gradually. In A549 cells, ethanol extracts caused severe cellular injury abrupt1y and lasted for 72 hours. However, cellular necrosis and growth inhibition in both of them could not be observed in 1, 10μg/ml ethanol extracts administration. Whereas, the effects of that were weak in all of concentrations and exposure times in HepG2 cells. In conclusion, green tea ethan이 extracts induced strong inhibition of growth and severe cellular damages in A549(Lung Cancer) and EATC except HepG2(Hepatoblastoma). In addition, its effects were dependent on concentration and duration of ethanol extracts. Therefore, though there were some different effect according to cancer type, it suggested that green tea would be helpful to prevent carcinogenesis and treat cancer.

재조합 BMP-7 adenovirus로 형질도입된 사람 진피섬유모세포를 이용한 아교스폰지에서의 뼈발생

류 탁(Tak Ryoo),김재룡(Jae-Ryong Kim),안면환(Myun-Whan Ahn),박정현(Jeong-Hyun Park),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Young Kim),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee),송인환(In-Hwan Song) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.4

사람에서 재조합 BMP-7 유전자를 뼈형성 및 재생에 활용하기 위하여, 조직공학적 방법과 유전자이식을 함께 응용하여 면역결핍생쥐에서 뼈형성을 유도하고자 하였다. 재조합 BMP-7 adenovirus를 사람 진피섬유모세포로 형질도입시킨 후 제1형아교용액과 함께 배양하여 아교스폰지를 만들고 이를 생쥐의 피하조직에 이식하여 1, 2, 4, 6, 8주에 2마리씩 희생시켜 뼈형성이 유도되는지를 조직표본염색, 투과전자현미경관찰, 방사선 촬영 등으로 조사하였다. 1주째의 아교스폰지 주위에 많은 수의 세포가 모여들어 있었고 이들과 섬유들이 동심원상으로 둘러싸며 피막구조를 형성하고 있었다. 피막 및 이와 인접한 이식된 아교스폰지 내에 혈관이 형성되었지만 아교스폰지 중심부의 세포는 핵이 농축되고 세포 사이의 경계가 불분명하였다. 이식 2주째에는 피막에 신생 뼈조직으로 보이는 산호성구조를 관찰할 수 있었다. 그 속에 뼈세포방을 가지고 있었고 시간이 경과하면서 영역이 확장되었다. 이들 구조에 대한 Von Kossa 염색에서 양성반응을 보여 뼈조직임을 확인하였다. 광학현미경관찰에서 연골로 보이는 구조는 보이지 않았지만 2주째의 전자현미경관찰에서 피막 주위에 소수의 연골모세포가 관찰되었다. 6주 이후부터 방사선사진상 이식부위에서 고음영을 관찰할 수 있었고 조직검사에서 아교스폰지 전 영역에 걸친 뼈형성을 관찰하였다. 바깥쪽으로는 겉질뼈가 형성되었고 안쪽에는 얼마간의 지주뼈가 형성되었으며 그 사이에 잘 발달된 혈관들과 지방세포들로 채워져 골수와 유사한 구조를 취하고 있었다. 이식된 아교스폰지 내의 뼈형성 빈도를 분석한 결과 1, 2, 4, 6, 8주 각각 0, 63, 88, 100, 100% (n = 8) 에서 뼈형성이 관찰되었다. 이상의 결과 재조합 BMP-7 adenovirus를 형질도입한 사람 섬유모세포와 아교스폰지를 담체로 이용해 얻은 본 실험의 면역결핍생쥐에서의 뼈형성은 사람에서의 재조합 BMP-7을 이용한 유전자이식의 또 다른 가능성을 보인 것이라 판단된다. As a preceding study to apply recombinant BMP-7 gene to the human, we investigated bone formation in immunodeficient mice by using tissue engineering and gene transplatation. Human dermal fibroblasts were transduced with AdBMP-7 and cultured with type I collagen solution to form collagen sponge. The collagen sponge containing AdBMP-7 transduced fibroblasts was transplanted into hypodermis of the mice and osteogenesis in the spongy was investigated by histochemical, electronmicroscopic, and radiologic methods at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks. At one week after transplantation, there were fluent cells infiltration around the collagen sponge and capsular structure was formed with fibers arranged in concentric circles. New vessel formation was observed in the capsule and subcapsular area of the sponge, but there were nucleus condensation and obscure cell boundary in the cells of the central region. Lacuna containing eosinophilic structures were observed in the capsular structure at two weeks. This structures were enlarged with time and were confirmed to be bone tissue by showing positive reaction for Von Kossa stain. Cartilaginous structure was not observed in light microscopic level, but a few chondroblasts were observed in pericapsular area in electron microscopic observation. After 6 weeks, radiopaque shadows were observed at the region of transplantation. Cortical bone was formed in periphery of the sponge while marrow like structure was observed in central region; some trabecula bone, adipocytes, and well developed vessels. The percentage of bone formation in transplanted sponge at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks were 0, 63, 88, 100, and 100% (n = 8), respectively. From these results, bone formation by BMP-7 transduced human dermal fibroblasts using collagen sponge scaffolds in immunodeficient mouse shows another potential way of human gene transplantation using recombinant BMP-7 adenovirus.

심장세포이식 시험관 모델에서 심장전사인자 Nkx2.5의 역할

신은경(Eun Kyung Shin),박정현(Jeong Hyun Park),김대중(Dae Joong Kim),한장희(Jang Hee Hahn),박경한(Kyeong Han Park),성훈기(Hoon Ki Sung),김주영(Joo Young Kim),송인환(In Hwan Song),성언기(Eon Gi Sung),이융창(Yung Chang Lee) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.1

최근 허혈성 심장질환 발생률이 크게 증가하고 있으며 줄기세포나 미분화 세포를 이용하여 허혈성 심장근육에 직접 주입하는 세포이식(Cell transplantation; cellular cardiomyoplasty)이 획기적인 치료방법으로 제시되고 있다. 그러나 세포이식의 대상이 되는 줄기세포의 분화기전이나 심장근육세포로의 분화유도 기전 또한 명확히 밝혀져 있지 않으며, 세포이식시 많은 수의 주입된 세포가 손실된다는 제한점이 있다. 따라서 본 연구에서는 세포 이식 효율을 증진시키고자 줄기세포주 P19에 심장발생을 조절하는 전사인자 MEF2c와 Nkx2.5 각각을 과발현 시킨 후, 심장근육세포로의 분화와 심장근육과의 동시 수축여부를 알아보기 위해 이와 밀접한 관련이 있는 세포사이결합 형성 유무, 그리고 저산소 처리에 대한 저항성을 관찰하였다. 면역염색시 P19-Nkx2.5 세포는 교통반점 단백질 connexin43이 대조군에 비해 발현양이 현저히 감소하였고, 전자현미경상 에서 근원섬유가 관찰되었다. 위 결과를 바탕으로 심장근육세포로의 분화여부를 확인하기 위해 cardiac troponin T (cTnT)의 분포를 관찰한 결과 일부 P19-Nkx2.5 세포에서 점 형태의 반응이 나타났다. 또한 저산소 처리시 P19-Nkx2.5 세포는 다른 실함군에 비해 세포 손상이 적었다. 아울러 심장근육세포와 혼합배양 결과 P19-MEF2c 세포와 P19-Nkx2.5 세포는 심장근육세포와의 경계면에서 교통반점과 부착판의 표지자에 대한 반응이 관찰되었다. 또한 cTnT 항체로 면역염색시 P19-Nkx2.5 세포에서 반응이 증가하였으며, 다른 혼합배양군에 비해 심장근육세포의 높은 수축수와 규칙적인 박동이 관찰되었다. 결과적으로 전사인자 Nkx2.5의 과발현에 의하여 줄기세포주 P19은 심장근육세포로 분화가 유도되었고, 심장근육세포와 혼합배양시 세포사이결합이 형성되었으며. 세포의 수축력도 유의하게 증가하였다. 또한 Nkx2.5의 과발현 군에서 저산소 처리시 강한 저항성을 나타내었다. 따라서 심장발생을 조절하는 전사인자인 Nkx2.5를 이용하여 다양한 이식세포를 구축하고 심장세포이식에 응용함으로서 심장질환에 대한 치료 효율성을 증가시킬 수 있으리라 기대한다. Despite therapeutic advance, the prevalence of ischemic heart disease continues to increase. Recently, cell transplantation of stem cell has been proposed as a strategy for cardiac repair following myocardial damage. However, low differentiation efficiency into cardiomyocyte and poor cell viability associated with transplantation have limited the reparative capacity of these cell. In this study, we engineered P19 embryonal carcinoma cells using plasmid vector to overexpress the transcription factor MEF2c, Nkx2.5 involved in cardiomyogenesis. We investigated 1) formation of intercellular junction of P19 in mono-culture and co-culture with cardiomyocyte for functional and structural synchronous contraction after transplantation, 2) differentiation into cardiomyocyte, 3) resistance to hypoxic condition. An P19 embryonal carcinoma cell line expressing GFP, MEF2c, Nkx2.5 was generated by gene transfection and clonal selection. Nkx2.5 overexpression induced connexin43 expression level decrease. Electron microscopy revealed myofibril organization and immunostaining with cTnT showed positive staining in P19-Nkx2.5, consistent with early stage cardiomyocyte. Connexin43 and N-cadherin was expressed between P19-MEF2c and cardiomyocyte, P19-Nkx2.5 and cardiomyocyte in co-culture. And beating rate of cardiomyocyte co-cultured with P19-Nkx2.5 increased much more than other group, even if P19-Nkx2.5 did not have synchronous contraction with cardiomyocyte. Additionally, P19-Nkx2.5 had a resistance against hypoxia. These result suggest that overexpression of Nkx2.5 induced differentiation of P19 into cardiomyocyte and would be electro-mechanical coupling with cardiomyocyte after transplantation. Futhermore, Nkx2.5 overexpression had protection potential to hypoxic injury. Therefore, P19 cell overexpressed Nkx2.5 would be promising cell source for further study of new therapy of myocardial disease and building up in vitro model.

상피성 암세포주에 대한 녹차 Catechin의 효과

박정현(Jeong Hyun Park),김대중(Dae Joong Kim),한장희(Jang Hee Hahn),김홍태(Hong Tae Kim),정용욱(Yong Wook Jung),성훈기(Hoon Ki Sung),김주영(Joo Young Kim),송인환(In Hwan Song),성언기(Eon Gi Sung),이융창(Yung Chang Lee) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.5

Catechin은 녹차에서 추출되는 폴리페놀의 주요성분으로 고혈압 및 동맥경화의 예방효과, 당뇨억제효과, 항산화작용, 항암작용 등에 직접 관여하는 물질이다. 본 연구에서는 태평양에서 제공받은 녹차 catechin을 이용하여 상피성 암세포주인 A549 (폐암)와 EATC (복수암)세포에 투여한 후 처리농도와 시간에 따른 변화를 비교, 관찰함으로써 녹차의 효과와 작용기전을 밝혀내는데 목적이 있었다. 본실험은 A549 세포와 EATC 세포를 배양한 후 녹차 catechin을 1, 10, 100, 500 μg/ml의 농도로 48시간 동안 처리하였고, 광학현미경, 공초점현미경, 전자현미경 등을 이용하여 세포의 구조적 변화를 확인하였으며 MTT분석, 전기영동, 유세포분석기 등을 사용하여 세포 손상정도를 파악하였다. A549 세포에서는 catechin 1 μg/ml와 10 μg/ml 농도에서는 대조군에 비하여 큰 변화를 관찰할 수 없었다. 100 μg/ml catechin을 처리하였을 때 세포내의 검은 과립들의 수가 증가하였고 층판소체의 손상이 나타났다. 세포주기의 장애가 나타나 DNA 합성전기에 있는 세포들의 수가 급격히 증가하였다. 500 μg/ml 농도에서는 층판소체와 사립체의 파괴가 심하게 나타났으며 세포생존율이 감소하였고 세포주기의 장애도 관찰되었다. EATC 세포에서는 catechin의 농도가 A549 세포의 경우보다 낮은 농도에서도 세포증식 억제 및 세포손상 효과가 나타났다. 10 μg/ml 농도에서도 세포의 위축과 생존율의 감소가 일어났으며 전기영동상에 괴사되는 세포들이 파악되었다. 100μg/ml catechin을 처리하였을 때 자연사의 형태학적 관찰, 전기영동, 유세포분석 등에서 자연사 과정에 있는 세포들이 많이 나타났다. 결과적으로 녹차 catechin을 배양한 상피성 암세포에 투여함으로서 세포의 생존율과 증식이 억제되었고 그 과정에서 괴사, 자연사, 세포주기의 장애 등이 관여하는 것으로 생각된다. 그러나 일련의 세포손상과정을 유도하는 데 있어 세포의 종류, 처리 시간, 농도에 따라 다소 차이가 있음을 확인하였다. Catechin is main component of polyphenol extracts from green tea, it is associated with prevention of hypertension and atherosclerosis, anti-diabetic effect, antioxidant, antitumor. The purpose of this research is to investigate the effect and its mechanism of green tea catechin on epithelial cancer cell lines in various concentrations and durations. For this study, epithelial cancer cell lines, A549 (lung cancer), EATC (Ehrlich-Lettre ascites tumor cell) were used. Inverted, light, confocal and electron microscopes were applied to find morphological changes. MTT assay, flowcytometric analysis, gel electrophoresis were used to compare severity of cellular damages to control after exposure to 1, 10, 100 and 500 μg/ml catechin for 48 hours. In the A549 cells, after 1 μg/ml and 10 μg/ml catechin treatments, there was no notable changes. However, exposure to 100 μg/ml catechin induced increase of cytoplasmic granules, destruction of lamellar body, inhibition of cell cycle, especially G0/G1. In the early phase of 500 μg/ml catechin administration, decrease of cell population, severe destruction of lamellar bodies and mitochondria, derangement of cell cycle were shown. In the EATC, such as those effects occurred after exposure to lower concentration of catechin than in that of A549 cells. After exposure of 10 μg/ml catechin, rounded-up cells and necrotic cells were found. Whereas, most of cells were under apoptotic changes-cytoplasmic condensation, nuclear fragmentation, cellular shrinkage, ladder pattern in the electrophoresis, when administrated 100 μg/ml catechin. These results suggested that exposure of catechin induced severe cellular damage and growth inhibition in dose- and time-dependent manner. And we confirmed that these effects of catechin were involved with apoptosis, necrosis and cell cycle arrest and were quite different according to cancer type. Therefore, much more research would be demanded before clinical application of catechin to human cancer therapy and this study would be the basic source for further study of green tea.