Fyn Tyrosine Kinase-mediated Tyrosine Phosphorylation of Roundabout (Robo), the Slit Receptor

전은숙(Eun Sook Jeon),배기원(Kee Won Bae),박환태(Hwan Tae Park) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.3

본 연구에서는 Slit의 세포막 수용체인 Roundabout (Robo)의 tyrosine 인산화의 분자적 기전을 연구하였다. Human embryonic kidney 세포에 인위적으로 발현시킨 Robo의 tyrosine 인산화는 tyrosine phosphatase 억제제의 처리에 의해 증가 되었으며, src family kinase의 억제제인 PP2의 처리에 의해 감소하였다. 활성화된 형태의 Fyn tyrosine kinase (Fyn)를 Robo와 함께 발현시켰을 때 Robo의 tyrosine 인산화의 증가가 관찰되었으나, 비활성 형태의 Fyn은 인산화를 증가 시키지 못하였다. 또한, 인산화된 tyrosine기에 결합하는 Fyn SH2도메인이 Robo와 결합함이 관찰되었으며 이 결합은 tyrosine phosphatase 억제제의 처리에 의해 증가되었다. 따라서 이러한 결과는 Robo의 tyrosine 인산화가 Fyn에 의해 매개됨을 시사한다. In this study, the molecular mechanism of tyrosine phosphorylation of Roundabout (Robo), the transmembrane receptor for slits, was investigated. The tyrosine phosphorylation of intracellular portion of Robo was increased by the treatment of tyrosine phosphatase inhibitors in human embryonic kidney cells transfected with Robo. The Robo tyrosine phosphorylation was inhibited by the treatment of Src family kinase inhibitor, PP2. The co-transfection of constitutively active form of Fyn, not the dominant negative form of Fyn, and Robo dramatically enhanced the tyrosine phosphorylation of Robo. Furthermore, the SH2 domain of Fyn, which binds to phosphorylated tyrosine residues, interact with Robo, and the interaction was increased by the inhibition of tyrosine phosphatases. These findings indicate that the tyrosine phosphorylation of Robo is regulated by Fyn.

배양한 연골세포와 이식편에서 Calcitonin-gene-related Peptide와 Type II Collagen 면역반응 및 형태학적인 변화

정호중(Ho-Joong Jeong),배기원(Kee-Won Bae),양영철(Young-Cheoul Yang) 대한해부학회 2000 Anatomy & Cell Biology Vol.33 No.5

성숙한 동물의 관절연골과 갈비연골로부터 연골세포를 분리하는 방법의 확립 및 배양한 두 연골세포의 표현형이 이식 전까지 유지되고 있는지를 type II collagen 면역반응으로 확인하고 이식편의 조직적응성을 calcitonin-gene-related peptide (CGRP)와 type II collagen의 면역반응으로 관찰하고자 하였다. 생후 6개월 된 1.5~2 kg 내외의 성숙한 토끼의 관절연골과 갈비연골로부터 분리된 연골세포를 배양하여 전형적인 표현 형이 유지되고 있는 관절연골세포를 갈비연골막 위에 배양하고 이식하여, 이식 연골에서 CGRP와 type II collagen의 면역반응 및 연골세포의 형태학적인 변화를 조사하였다. 관절연골세포는 일차와 이차 계대배양에서 외형적 표현형을 유지하였으나, 갈비연골세포는 섬유모세포 모양의 세포로 표현형이 변화되었다. 관절연골세포를 갈비연골막에 접종했을 때 활착력이 좋았고 부착된 세포들은 납짝해지면서 가장자 리에 연골을 형성하고 있었다. 관절연골세포와 갈비연골세포의 배양에서 모든 연골세포들의 type II collagen 반응이 소실하지는 않았다. 성장이 빠르고 표현형을 잘 유지한 관절연골세포를 이식하여 형성된 이식편의 CGRP 면역반응은 전체적으로 증가하였으며, type II collagen 면역반응은 감소하였다. 전자현미경 소견에서 배양된 관절연골세포는 매우 크고 밝은 핵과 세포질내 소수의 과립들, 소포들이 풍부하였으나, 배 양시간이 경과하면서 핵이 위축되고 세포질내 많은 큰 공포들이 관찰되었으며, 갈비연골막위에 배양하면 세포막아래에 분절상으로 배열하고 있는 과립세포질세망들과 가늘고 짧은 융모들이 관찰되었다. 배양한 관절연골세포는 전형적인 연골세포의 형태를 유지하며 type II collagen 반응은 소실되지 않았다. 관절연골세포는 거의 완전한 세포소기관과 뚜렷한 핵소체와 활성화된 염색질을 가지고 있었고, 갈비연골막 접종에서는 분절상 과립세포질세망들로 보아 증식하는 미성숙한 연골세포의 형태를 나타내었다. 이식한 부위의 관절연골세포는 시간경과에 따라 세포소기관들이 소실되었으며, CGRP에 의해서 변성이 일어나 type II collagen 반응이 점차 감소된다는 것을 알 수 있었다. The purpose of this study was to investigate the immunohistochemical reaction of calcitonin-gene-related peptide (CGRP) and type II collagen and also morphological changes of cartilage implants and cultured chondrocytes isolated from the articular and costal cartilages. The chondrocytes were isolated from the head of the femur and the 11th costal cartilage of the 6 months old rabbits. De novo implants were prepared from the chondrocytes cultured on the perichondrium by culturing isolated articular chondrocytes. Cultured chondrocytes and implants were evaluated by immunohistochemical staining of CGRP and type II collagen and electron microscopy. Articular chondrocytes maintained the typical phenotype in the 1st and 2nd subcultures, but the costal chondrocytes were transformed into fibroblast-like cells. The articular chondrocytes cultured on the perichondrium were more flattened and formed the cartilage. Most chondrocytes were no loss of type II collagen immunostaining by culturing. Implants replaced by the cultured articular chondrocytes were generally increased CGRP and decreased type II collagen immunoreaction. Electron microscopically the cultured articular chondrocytes had a large euchromatic nucleus, a few granules, and abundant vesicles. During culture, the nucleus became atropy and the cytoplasm contained many large vacuoles. The chondrocytes cultured on the perichondrium showed a lot of segmented rough endoplasmic reticulum and fine short microvilli. During culture, articular chondrocytes maintained typical phenotype and type II collagen reaction. The cultured articular chondrocytes had some organelles and euchromatic nucleus with prominent nucleolus. The chondrocytes cultured on the perichondrium showed active secretion of the matrix with small vesicles and well developed endoplasmic reticulum. The implanted articular chondrocytes showed the decrease of their organelles after secretion of the marix and became increased CGRP and decreased type II collagen immunoreaction.

신경계에서 Ras-like GTPase 활성화의 신호전달계에 대한 연구

김도형(Do-Hyung Kim),박중규(Joong-Kyu Park),배기원(Kee-Won Bae),박환태(Hwan-Tae Park) 대한해부학회 2001 Anatomy & Cell Biology Vol.34 No.1

신경연접의 성숙과 기억의 생물학적인 기전으로 알려져 있는 신경연접 가소성의 분자적 기전을 이해하기 위하여 Ras 유사단백질인 Rac과 Rho, 그리고 이들의 상위신호전달인자라 여겨지는 proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2)와 focal adhesion kinase (FAK)의 활성화 기전을 PC12 세포와 흰쥐 뇌를 이용하여 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. PC12 세포에서 탈분극에 의한 extracellular signal-regulated kinase (ERK)의 활성화는 관찰되었으나 Rac과 RhoA의 활성화는 관찰되지 않았다. 2. 전기충격으로 야기시킨 전신성 경련이후 ERK의 활성화 및 c-fos의 발현을 관찰할 수 있었으나 Rac과 RhoA의 활성화는 관찰되지 않았다. 3. 전기충격으로 야기시킨 전신성 경련이후 PYK2의 활성화는 관찰되었으나 FAK의 활성화는 관찰할 수 없었다. 4. 출생 후 발육과정동안에 PYK2의 발현 및 활성도의 증가가 관찰되었으나, FAK의 활성도는 성숙할수록 감소하였다. 5. 흰쥐 뇌에서 이들의 세포내 분포를 밀도차 원심분리법을 이용하여 조사한 결과, Rac과 PYK2는 신경연접후 치밀질에 많이 분포하였으나 RhoA와 FAK는 거의 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아 신경연접의 성숙 및 신경활성도 변화에 따른 신경연접의 기능변화에는 PYK2가 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. Synaptic plasticity has been thought to be a mechanism of synaptic maturation, learning and memory. In this study, the possible involvement of Rac, RhoA, proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2) and focal adhesion kinase (FAK) in the synaptic plasticity was investigated using PC12 cells and rat brains. The followings are the results. 1. Depolarization induced extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation but did not activate Rac and RhoA in PC12 cells. 2. ERK activation and c-fos expression were observed after electroconvulsive shock (ECS) but the activity of Rac and RhoA was not changed following ECS. 3. PYK2 not FAK activation was observed after ECS. 4. The activity of PYK2 was increased with postnatal development but that of FAK was decreased with ages. 5. The expression of Rac and PYK2 was clearly observed in the postsynaptic density but that of RhoA and FAK was not. These findings indicate that PYK2 seems to play an important role in activity-dependent synaptic plasticity in vivo brain.

흰쥐의 한쪽 콩팥 절제 후 남은 콩팥의 토리와 근위세관의 조직학적 및 형태계측학적 변화

양영철(Young-Cheoul Yang),손호열(Ho-Yeul Son),배기원(Kee-Won Bae) 대한체질인류학회 1999 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.12 No.1

생후 1년 된 Sprague Dawley계 암컷 흰쥐에서 한쪽 콩팥을 절제한 후 각각 20일, 30일, 49일이 경과한 다음 남은 콩팥에서 관찰되는 토리와 근위세관의 조직학적인 변화와 형태 계측학적인 변화를 광학 및 전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 토리의 단면적은 콩팥 절제 후 30일군에서 가장 크게 증가하였으며 토리의 평균 직경도 30일군에서 현저하게 증가하였다. 2. 토리 내 세포들의 핵 크기는 발 세포는 현저하게 증가하였고 바깥벽세포는 감소하는 경향을 나타냈으며 내피세포는 20 일군에서 약간의 증가를 보였을 뿐 거의 정상이었다. 3 절제 후 20일군에서 토리의 내피세포 내강이 불규칙하게 주름 잡혔고 30일군이 전자현미경소견으로는 현저한 기저 막의 비후를 나타내었다. 4 근위세포의 평균직경과 단면적은 절제 후 30일군에서 현저한 증가를 나타내었으며 평균직경은 정상으로 돌아오지 않았고 두께는 40일군에서는 정상으로 회복되었다. 5. 광학현미경상 근위세관의 조직학적인 변화는 거의 정상 대조군과 큰 차이가 없었으나 전자현미경 소견 상 30일군은 세포질 내를 완전히 채울 정도로 사립체가 수와 크기가 증가하였고 40일군에는 세포질 내 큰 공포들을 관찰할 수 있었다.

A Study on the Expression of Immediate-early Genes by Light Stimuli in the Rat Suprachiasmatic Nucleus Using Differential Display

박환태(Hwan Tae Park),김우일(Woo Il Kim),강은경(Eun Kyoung Kang),박중규(Joong Kyu Park),배기원(Kee Won Bae) 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4

포유동물의 시각교차위핵은 일주기성 리듬을 생성하는 circadian pacemaker이다. 동물의 행동리듬을 전위시키는 빛 자극에 의해 여러 유전자들의 발현이 시각교차위핵에서 유도되고, 이러한 유전자들의 발현이 행동리듬의 전위에 관여한다고 알려져 있다. 본 연구에서는, differential display-polymerase chain reaction (DD-PCR)법을 이용하여 빛에 의해 발현이 유도되는 유전자를 조사하고 그 발현을 검증하였다. 또한 신경세포의 흥분에 의해 발현이 유도되는 Arc와 Rheb mRNA의 발현이 시각교차위핵에서 빛 자극에 의해 유도되는 지를 조사하였다. DD-PCR법을 이용하여 빛에 의해 시각교차위핵에서 발현이 증가하는 25개의 clone을 얻었고, 그 중에서 하나의 clone (clone No. 18, human A6 kinase의 흰쥐 상동체)이 시각교차위핵에서 주관적인 밤주기동안 빛에 의해 발현이 증가됨을 확인하였다. 이 결과는 clone 18이 빛에 의한 동물 행동리듬의 전위에 관련되어 있음을 시사한다. 한편, 시각교차위핵에서 Arc와 Rheb mRNA의 발현은 빛에 의해 발현이 증가되지 않았다. The hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN) of the mammal is the circadian pacemaker responsible for generation of circadian rhythms. Several immediate-early genes are expressed in the SCN by light stimuli which induce phase shifts of animal activity rhythms. By using differential display-polymerase chain reaction, we investigated expression of several immediate-early genes in the light-stimulated SCN. In addition, we analyzed the light-induced expression changes of two known immediate-early genes, Arc and Rheb, in the SCN. We have screened and cloned 25 differentially expressed genes in the SCN, and identified a gene, a rat homologue of A6 kinase, which expression was regulated by light stimuli. One hour light stimuli during the subjective night dramatically induced the gene expression in the SCN, whereas light stimuli during the subjective light phase did not. This finding implies that a rat homolgue of A6 kinase may be involved in the photic entrainment of the circadian clock. On the other hand, Arc and Rheb mRNA expressions were not increased in the SCN by light stimuli.