돼지에서 TRAF4 유전자 특성 및 Tight junction 관련 기능 분석

윤정희(Jeong-hee Yun),황인설(In-Sul Hwang),황성수(Seongsoo Hwang),박미령(Mi-Ryung Park) 한국산학기술학회 2020 한국산학기술학회논문지 Vol.21 No.5

Tumor necrosis factor receptor associated factor 4 (TRAF4)는 사람의 유방암에서 과발현 되며, 암세포전이, ROS 및 세포 극성 형성 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 돼지에서는 아직까지 그 기능과 특성에 대한 연구가 보고 된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 돼지 TRAF4의 mRNA 전장서열을 분석하고, 그 기능과 특성을 알아보고자 수행되었다. TRAF4의 전장서열을 밝히기 위해 돼지 신장유래세포(pK15)에서 total RNA 추출하여 RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) PCR을 수행하였다. 2,030 염기쌍의 mRNA 전장서열을 분석하였고, 470개의 아미노산으로 구성 되어 있는 것을 확인하였다. 사람과 쥐의 Homology를 분석한 결과 각각 93 % 그리고 90 %의 유사도를 가지며, 사람과는 8개, 쥐와는 12개의 아미노산 차이가 있음을 확인하였다. qPCR을 통하여 TRAF4, CLDN4, OCLN 그리고 TJP1의 발현을 분석한 결과 세포의 confluency 정도에 따라 발현이 다르게 나타남을 확인하였고, 세포가 40% 증식한 그룹 보다 60 %와 80 % 이상 증식 한 그룹에서 유의적으로 높게 나타났다. 또한 TRAF4의 기능을 확인하기 위하여 TRAF4 siRNA 처리 한 결과 TRAF4와 tight junction 관련 유전자가 낮게 발현됨을 관찰하였다. 따라서 사람과 마우스와 같이 돼지에서도 TRAF4가 발현되며, 세포-세포 간 중요한 역할을 하는 tight junction에 관여하는 것으로 사료된다. Tumor necrosis factor receptor associated factor 4 (TRAF4) is found to be overexpressed in human breast cancer. It plays a role in cancer metastasis, production of reactive oxygen species, and cell polarity at membranes. The characteristics and functions of TRAF4 in pigs have not yet been identified. As the first step of research, the mRNA sequence of TRAF4 in porcine cells has been determined. To obtain the full-length sequence, rapid amplification of cDNA ends (RACE) has been carried out. Upon cloning, 2,030 bp of nucleotides were found to encode 470 amino acids, and 8 and 12 amino acids were different from those of the human and mouse TRAF4, respectively. The coding region of porcine TRAF4 was shown to be 93% and 90% homologous to human and mouse TRAF4, respectively. qPCR was conducted to determine the relative expression level of TRAF4. TRAF4 expression in pK15 was enhanced by cell-cell contacts. The mRNA levels of CLDN4, OCLN, and TJP1 at 60% and 80% confluency were significantly higher than at 40% confluency. Further, TRAF4 and tight junction-related genes were down-regulated upon treatment with TRAF4 siRNA. Thus, TRAF4 may affect the function of tight junctions in pig.

사람 조직 플라스미노겐 활성인자 생산용 형질전환 돼지에서의 혈액학적 성상 비교

박미령(Mi-Ryung Park),황인설(In-Sul Hwang),이승훈(Seunghoon Lee),이휘철(Hwi-Cheul Lee) 한국산학기술학회 2020 한국산학기술학회논문지 Vol.21 No.12

해부학적, 생리학적으로 인간과 유사한 특성을 지닌 돼지를 이용한 실험은 의학적 분야에서 폭넓게 이용되고 있다. 돼지에서 혈액의 일반적인 성상과 이화학적 수치는 의학적 연구 및 수의학적 치료에서도 중요한 부분으로 인정되고 있으나, 형질전환 돼지에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 htPA 형질전환 돼지의 혈액을 이용한 일반성상 및 이화학적 성상을 비교 분석하여 형질전환 돼지에 대한 기초 자료로 활용하고자 조사하였다. 일반돼지 7(LY)두와 형질전환 돼지 8(LY)두의 혈액을 각각 분석하였다. 혈액의 일반 성상은 16종을 분석하였으며, 혈청을 이용한 이화학 분석의 경우 15종 항목을 조사하였다. 그 결과 혈액의 일반 성상 분석에서는 적혈구(RBC), 평균적혈구 혈색소량(MCH)과 임파구(LYM)에서 두 그룹간 유의적 차이를 나타내었다. 이화학적 성상 분석에서는 혈중뇨소질소(BUN), 총단백질(TP), 콜레스테롤(CHOL), (ALT), 크레아틴(CREA), 감마글루타밀전이효소(GGT), 글로빈(GOB) 그리고 아밀라아제(AMYL)가 두 그룹간 유의적 차이를 나타내었다. 앞으로 지속적인 형질전환 돼지에 대한 생체정보를 조사함으로써, 기초자료로 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 더 나아가 의학적 연구 분야에 적용 시 참고할 수 있을 것으로 여겨진다. Pigs have been used widely in biomedical research owing to their physiologic and anatomic similarities to humans. Analysis of the hematologic and biochemical values in pigs is an important basis for biomedical research and veterinary clinical diagnosis, but research on transgenic pigs has been sparse. This study was conducted to obtain basic data on transgenic pigs and to describe and compare the reference values for hematologic and biochemical parameters in human tissue plasminogen activator (htPA) transgenic pigs vs normal pigs. Blood samples were obtained from 7 normal LY (Landrace-Yorkshire crossbred) pigs and 8 transgenic pigs and 16 hematologic and 15 serum biochemical parameters were tested. Among the hematologic parameters tested, significant differences were observed in the red blood cells (RBC), mean red blood cell hemoglobin (MCH), and lymphocytes (LYM), between the non-transgenic and transgenic pigs. Among the biochemical parameters tested, the blood urea nitrogen (BUN), total protein (TP), cholesterol (CHOL), alanine aminotransferase (ALT), creatinine (CREA), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), globin (GOB), and amylase (AMYL) showed significant differences between the two groups. Thus, the values determined in this study can be used as basic reference values for transgenic pigs and will contribute to their use in biomedical research.

3D8 scFv 형질전환 돼지 개발 및 PRRS 저항성 평가

이휘철 ( Hwi-cheul Lee ),이건섭 ( Gunsup Lee ),김지윤 ( Ji-yoon Kim ),양현 ( Hyeon Yang ),이보람 ( Bo Ram Lee ),박미령 ( Mi-ryung Park ),황인설 ( In-sul Hwang ),이풍연 ( Poongyeon Lee ),변승준 ( Sung-june Byun ),김원일 ( Won-il K 한국동물위생학회(구 한국가축위생학회) 2020 韓國家畜衛生學會誌 Vol.43 No.4

In this study, we have developed 3D8 scFv transgenic pig (TG) by microinjection of fertilized one-cell pig zygotes (2.17%). The effect of 3D8 scFv TG on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) resistance were evaluated through PRRSV VR2332 (1×10 ³ TCID₅₀/mL) challenge and transmission experiments. As a result, the average daily weight gain (ADWG) of TG increased compared to the wild type pigs (WT) in PRRSV challenge groups and the serum viremia levels of the TG was significantly lower than of WT on the 7 day and 21 day after infection, meaning that the viral shedding was suppressed by 3D8 scFv expression. These results suggest that the expression of 3D8 scFv in pig could suppress spreading of infected virus to pigs sharing a room.

alpha 1,3-galactosyltransferase 기능 제거 및 MCP 발현 형질전환 돼지의 대동맥 혈관내피세포에 CD37/CD73 발현 세포주 개발

노진구,변승준,양현,옥선아,우제석,이휘철,황인설,김지윤,박상현,이주영,오건봉,No, Jin-Gu,Byun, Sung-June,Yang, Hyeon,Ock, Sun A,Woo, Jae-Seok,Lee, Hwi-Cheul,Hwang, In-sul,Kim, Ji-Youn,Park, Sang Hyoun,Lee, Joo Young,Oh, Keon Bong 한국수정란이식학회 2018 한국동물생명공학회지 Vol.33 No.3

Acute vascular rejection has been known as a main barrier occurring in a xenograted tissue of alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out (GalT KO) pig into a non-human primate (NHP). Adenosine which is a final metabolite following sequential hydrolysis of nucleotide by ecto-nucleotidases such as CD39 and CD73, act as a regulator of coagulation, and inflammation. Thus xenotransplantation of CD39 and CD73 expressing pig under the GalT KO background could lead to enhanced survival of recipient NHP. We constructed a human CD39 and CD73 expression cassette designed for endothelial cell-specific expression using porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD39/hCD73). We performed isolation of endothelial cells (pAEC) from aorta of 4 week-old GalT KO and membrane cofactor protein expressing pig ($GalT^{-MCP/-MCP}$). We were able to verify that isolated cells were endothelial-like cells using immunofluorescence staining analysis with von Willebrand factor antibody, which is well known as an endothelial maker, and tubal formation assay. To find optimal condition for efficient transfection into pAEC, we performed transfection with GFP expression vector using four programs of nucleofection, M-003, U-023, W-023 and Y-022. We were able find that the program W-023 was optimal for pAEC with regard to viability and transfection efficiency by flow cytometry and fluorescent microscopy analyses. Finally, we were able to obtain $GalT^{-MCP/-MCP}/CD39/CD73$ pAEC expressing CD39 and CD73 at levels of 33.3% and 26.8%, respectively. We suggested that pACE isolated from $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig might be provided as a basic resource to understand biochemical and molecular mechanisms of the rejections and as an alternative donor cells to generate $GalT^{-MCP/-MCP}/CD39/CD73$ pig expressing CD39 and CD73 at endothelial cells.

칡소 동결 정액 생산을 위한 스티로폼상자와 액체질소 이용 방법

김성우(Sung Woo Kim),고응규(Yeoung-Gyu Ko),이재영(Jae-Yeong Lee),김찬란(Chan-Lan Kim),황인설(In-Sul Hwang) 한국산학기술학회 2020 한국산학기술학회논문지 Vol.21 No.4

가축유전자원으로서 동결정액을 생산하는 가장 쉬운 방법은 스티로폼박스를 이용한 간이동결법으로 알려져 있다. 본 연구에서는 스티로폼 동결박스를 제작하여 가축의 동결정액 생산에 활용하는 방법을 검토하였으며 칡소 동결정액 생산을 최적화 할 수 있는 방법을 제시하고자 박스의 크기, 액체질소와 노출된 정액 스트로와 거리, 노출시간 및 생산량을 검토하였다. 2가지 동결박스를 비교하여 자료를 확보하였으며 내부 크기는 세로×가로×높이가 23.5×30.5×22.5cm와 25.5×46.5×26.5 cm로 측정되었다. 액체질소를 5cm 높이로 채우고 액체질소 위 2, 5 및 8cm 높이에서 동결하여 융해 후 생존성을 조사하였다. 칡소 정액을 동결할 경우, 액체질소와의 노출시간은 모두 10분이 적절하였으며 25.5×46.5×26.5 cm 크기의 상자가 높은 생존율을 보여주었다(60.4±5.3% 대 67.2±3.1%). 동결 상자의 최적화 공간은 정자 동결에 가장 중요한 요소로 판단되며 1회 동결 시 최대 생산 가능한 칡소 동결정액은 60개 이상으로 증가시킬 수 있었다. 이러한 정보를 활용하면, 축종에 따라 동결 정액 생산량 결정하고 목적에 맞는 용기를 활용하여 효율적인 동결정액 생산이 가능할 것으로 판단된다. A styrofoam box is used as a simple and easy freezing method to preserve animal semen as a livestock genetic source. This study optimized the methods of freezing chikso brindled cattle semen. To test the freezing box, the motility of spermatozoa was compared between two box sizes (length×width×heigh) with the dimensions of 23.5×30.5×22.5 cm and 25.5×46.5×26.5 cm. The motility of thawed sperm from brindled Korean bulls was used to confirm the efficiency of the freezing boxes. The box having a larger inner space with larger horizontal and height measurements supported better motility after thawing (60.4±5.3% vs 67.2±3.1%) with 10 min of exposure time in liquid nitrogen vapor. The optimized freezing space is estimated to be an essential element for successful freezing results and the larger box could be used for production of more than 60 frozen semen straws. These properties are also helpful to optimize the cryopreservation techniques that would control the quality and quantity of semen straws according to different animal species.