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Vitamin K1의 첨가가 돼지 체외 수정란의 발달과 생존율에 미치는 효과
박흠대,주역진,박용수 韓國受精卵移植學會 2014 한국동물생명공학회지 Vol.29 No.1
The in vitro production of porcine embryos was essential to increase of blastocyst development rate and select of high quality blastocyst in early stage. There were a lot of reports about in vitro porcine embryo development, but there was no report about the selection of high quality embryos. Therefore, in this study, we investigated the effect of vitamin K1 (vit K1) on the development and survival rate of porcine in vitro fertilized embryos. When vit K1 was treated for 24 hr at day 1 in vitro culture, blastocyst development rate in the control group (35.5 ± 3.2%) was significantly lower compared to 1.0 μM, 3.0 μM, or 6.0 μM groups (14.5 ± 4.3, 0.0, or 0.0%; p<0.05). The survival rates of blastocysts at day 8 in 1.0 μM, 3.0 μM or 6.0 μM of vit K1 treated groups (22.2 ± 2.9, 0.0 or 0.0%) were significantly lower than that of the control group (31.8 ± 2.6%; p<0.05). We were added at 1.0 μM, 3.0 μM or 6.0 μM vit K1 for different durations of time at day 1 in vitro culture. The development rate and survival rate in the group of 1.0 μM vit K1 for 6 hr was 26.5 ± 2.9% and 47.2 ± 2.8%, respectively, which were differed significantly in the group of 12 hr (p<0.05). In the group of 3.0 μM vit K1, the blastocyst development in control group was 36.4 ± 3.1% but, the survival rate 41.7 ± 3.2% in the group of 3.0 hr was significantly higher than that of the control group (p<0.05). In the group of 6.0 μM vit K1, the control group’s the blastocyst development was 32.0 ± 2.8% and the 0.5 hr supplement group’s survival rates was 42.9 ± 1.8% higher than other groups. We added vit K1 at day 1, day 2, day 4 and day 6 of in vitro culture, on the based the results of supplemented concentration and duration. In the group of 1.0 μM 6.0 hr addition, the blastocyst development rate of day 4 and the survival rate of day 2 were the highest in each group. In the groups of 3.0 μM 3.0 hr addition or 6.0 μM 0.5 hr addition, the blastocyst development (59.5 ± 4.1% and 50.0 ± 3.6%) and survival rates (72.7 ± 5.4% and 79.2 ± 4.0%) on day 4 were significantly higher than that of control and other experiment groups (p<0.05). Meanwhile, the number of cells in blastocysts that produced by vit K1 supplementation was 53.4 ± 5.8, 49.4 ± 3.8 and 51.5 ± 4.5 respectively, which were significantly higher than that of 40.2 ± 2.3 in the control group (p<0.05). There was no difference of the number of apoptotic cells between control and experiment groups. In addition, gene expression of survival blastocyst, the Bax mRNA expression was similar between the control and the experiment groups. However, Bcl-xL mRNA expression’s in the group of 6.0 μM 0.5 hr on day 4 was highest among control and experiment groups (p<0.05). In this study suggested that the control of concentration, duration and time was effective on the survival and cell number of porcine blastocyst derived from in vitro. We are not know what the exact reasons of the effect of vit K1 on embryo development and need to fur ther study. However, vit K1 might be using the selection of high quality porcine blastocyst. 돼지 수정란의 체외 생산 효율성 향상을 위해서는 배발생율과 더불어 고품질의 배를 조기에 선별해야 한다. 체외 배 발생율에 대한 보고는 많지만, 고품질의 배를 선별할 수 있는 기술에 대한 연구는 거의 없었다. 본 연구에서는 돼지 난포란 유래 수정란의 체외배양에 있어서 배반포로의 배 발달과 생존에 미치는 Vitamin K1(vit K1) 첨가 농도, 시기 및 시간의 효과를 검토하였다. 1.0 μM, 3.0 μM 및 6.0 μM vit K1을 배양 1일째 24시간 첨가한 결과, 배반포 발달율이 시험군이 14.5 ± 4.3, 0.0 및 0.0%로써 대조군의 35.5 ± 3.2%에 비하여 유의하게 낮았고(p<0.05), 배반포의 생존율도 대조군이 31.8 ± 2.6%로써 시험군의 22.2 ± 2.9, 0.0 및 0.0%에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05). 상기 첨가 농도에서 첨가 시간을 달리한 결과, 1.0 μM 농도에서 6시간 처리군의 배반포 발달율과 생존율이 각각 26.5 ± 2.9% 및 47.2 ± 2.8%로써 가장 높았고 특히, 12시간 처리군보다 유의하게 높았다(p<0.05). 3.0 μM 농도에서는 대조군의 배발달율이 36.4 ± 3.1%로 가장 높았으나, 생존율은 3.0시간 첨가군이 41.7 ± 3.2%로 대조군에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05). 6.0 μM 농도에서도 배발달율은 대조군(32.0 ± 2.8%), 생존율은 0.5시간 첨가군(42.9 ± 1.8%)이 가장 높았다. 각각의 vit K1 첨가 농도와 시간을 기준으로 서로 다른 배양 시기에 첨가한 결과, 1.0 μM 6시간 첨가군에서는 배반포 발달율은 배양 4일째 첨가군, 생존율은 배양 2일째 첨가군이 가장 높았다. 한편, 3.0 μM 3.0시간 및 6.0 μM 0.5시간 첨가군에서는 배양 4일째 첨가군의 배반포 발달율(59.5 ± 4.1% 및 50.0 ± 3.6%)과 생존율(72.7 ± 5.4% 및 79.2 ± 4.0%)이 대조군과 다른 시험군에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05). 한편, vit K1 첨가에 따른 배반포의 세포 수를 조사한 결과, 첨가군(1.0 μM 6시간 배양 2일째, 3.0 μM 3.0시간 배양 4일째 및 6.0 μM 0.5시간 배양 6일째)이 53.4 ± 5.8, 49.4 ± 3.8 및 51.5 ± 4.5개로써 대조군의 40.2 ± 2.3개에 비하여 유의하게 많았다(p<0.05). 그러나 사멸세포 수는 시험군이 3.2 ± 0.9∼3.7 ± 2.1개로써 대조군의 4.2 ± 1.2개보다 적었으나, 유의차는 없었다. 세포 사멸 유도 유전자인 Bax mRNA 발현은 처리군과 대조군은 비슷하였으나, 세포 사멸 억제 유전자인 Bcl-xL mRNA 발현은 처리군이 대조군보다 높았고 특히, 6.0 μM 0.5시간 배양 4일째 첨가군이 가장 높았다. 이상의 결과로부터 돼지 미성숙 난포란 유래 수정란의 체외 배양에 vit K1의 첨가는 배반포의 생존율과 세포수 증가에 효과적이었다. 그 이유에 대해서는 아직 많은 부분이 밝혀져야 되겠지만, 고품질의 배반포 조기 선발에는 활용이 가능할 것으로 생각된다.
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