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미토콘드리아 DNA 유전체를 이용한 한국에 서식하는 노랑부리백로(Egretta eulophotes)의 계통지리학적 연구
진선덕 ( Seon Deok Jin ),전재훈 ( Jae Hoon Jeon ),김인규 ( In Kyu Kim ),백인환 ( Soo Young Lee ),이수영 ( In Hwan Paik ),정옥성 ( Ok Seong Jeong ),조성웅 ( Seong Woong Jo ),강정훈 ( Jeong Hoon Kang ),임정희 ( Jeong Hei Lim ),유재 한국환경생태학회 2014 한국환경생태학회 학술대회지 Vol.2014 No.2
노랑부리백로(Egretta eulophotes)는 천연기념물 제 361호이며, 멸종위기 Ⅰ급으로 등록 되어 있다. 국제적 희귀종으로 IUCN의 Redlist에 취약종(Vulnerable: VU)이며, 야생에서 2, 500개체 미만만이 남은 것으로 알려져 있다. 국내에서 노랑부리백로 집단번식지는 1987년 신도에서 최초 발견되어 천연기념물 360호로 지정받았고, 1991년 약 400여 둥지가 관찰되었으나, 이후 인위적 방해요인으로 인접 섬으로 이동하여 신도에는 현재 번식하지 않는다. 최근 노랑부리백로의 번식이 확인된 곳은 천연기념물로 지정되어 보호받는 영광군 칠산도(제 389호), 연평도, 구지도, 서만도, 황서도, 보령의 목도 등이 있다. 노랑부리백로는 서해안 무인도서에서 집단으로 번식하고 있고, 전 세계 최대 번식집단을 형성하고 있다. 한편, 노랑부리백로와 같이 무인도서에 서식하는 종은 외부 위협 요인에 쉽게 취약하거나 교란될 수 있고, 괭이갈매기와 같이 무인도서내 집단번식의 확산은 서식지 감소로 이어져 멸종위기로 이어지고 있다. 이러한 점 때문에 종의 개체군 구조, 유전적 다양성, 소수개체군의 유전자 관리에대한 분자생물학적 연구 방법은 노랑부리백로와 같이 무인도서에서 집단으로 번식하는 멸종위기종의 보전에 중요한 정보와 기초자료를 제공할 수 있다. 본 논문은 노랑부리백로 서식지의 개체군 조사와 더불어 NGS(Next Generation Sequencing)의 빠른 분석기법을 이용하여 노랑부리백로의 미토콘드리아 유전체 분석과 계통분류를 수행하고 근연종과의 비교를 통해 종 다양성 및 개체군 보전을 위한 기초자료로 이용하고자 한다. 노랑부리백로 번식 및 서식현황을 파악하기 위해 문화재청의 허가를 받고, 번식 및 서식 피해를 최소화하면서 번식지내 노랑부리백로 43개체의 혈액, 조직(사체), 알껍질 등에서 유전자원을 확보하였다. 이후 DNA 추출 후 QC테스트 한 총 18개체의 유전자원 샘플로 2개의 primer set을 제작하고 PCR 증폭을 진행한 후 100bp 이상 조각으로 해독하여, 약 1. 2Gb의 미토콘드리아 유전체 데이터를 생산 및 분석하였다. 노랑부리백로의 번식현황 조사결과 전남 영광군의 칠산도, 납대기섬, 서만도, 황서도, 보령의 목도(나무섬) 등에서 번식이 확인되었다. 하지만 기존 번식지이었던 신도, 구지도, 비도, 예도 등에서는 번식을 확인할 수 없었다. 최근 10년간 노랑부리백로의 둥지 수 변화를 보면 2004년 674개의 둥지에서 2006년 461개, 2008년 524개의 둥지로 감소하였다가 2010년 696개로 증가한 후, 본 조사인 2013년에는 367개로 감소하였는데, 이는 구지도의 번식 집단이 사라졌고, 서만도와 황서도의 개체군이 감소한 결과로 판단된다. NGS로 생산된 데이터를 기 보고된 노랑부리백로의 reference sequence에 BWA 프로그램을 이용하여 align을 수행하였으며, samtools를 이용하여 각 샘플별 미토콘드리아 서열을 생산하였다. 전체 미토콘드리아 서열을 비교해본결과, 총 87개의 위치에서 다형성(polymorphism)이 발견되 었으며, 대부분이 D-loop(Control region)에 모여 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 기 보고된 중국의 노랑부리백로 데이터와 비교한 결과, 새로운 두 개의 Haplotype이 한국 노랑부리백로에 있음을 확인하였다. 미토콘드리아의 유전자 다양성을 측정하기 위해 기 보고된 중국의 노랑부리백로 데이터의 미토콘드리아 서열 중 D-loop 영역의 일부를 DnaSP 프로그램을 이용하여 비교하였다. Haplotype/Nucleotide diversity를 계산한 결과 각각 0. 956, 0. 00908을 얻었고, 중국의 노랑부리백로(Haplotype diversity: 0. 920, Nucleotide diversity: 0. 00878)에 비해 높게 나타났다. Tajima``s D test를 통해 한국에 번식하는 노랑부리백로의 미토콘드리아 control region에 선택압 (selection pressure)이 없다는 결과도 확인할 수 있었다. 한국과 중국에 서식하는 노랑부리백로의 지리적 변이를 확인하기 위하여, Arlequin을 통해 AMOVA (Analysis of Molecular Variance)를 진행하였으며, Haplotype frequency를 이용하였을 때 약 2. 27 %의 variation 차이가 있음을 확인할수 있었으며, Genetic distance를 이용하였을 때는 유의한 값을 얻을 수 없었다. 또한 번식지별로 개체군간 차이가 있는지 확인해보았으나, 샘플의 수가 적어 통계적으로 유의한 값이 도출되지 않았다. 노랑부리백로의 번식지별 개체군간의 비교와 새롭게 발견된 Haplotype의 분석을 위하여 RAxML을 이용하여 계통도 분석을 한 결과, 특별하게 번식지별로 클러스터링(clustering) 되지 않아 번식지별 차이가 없었다. 한편, KHap1, KHap2는 이번 연구에서 새롭게 발견된 Haplotype으로서 기 보고된 중국의 노랑부리백로 Haplotype 과 클러스터링이 되는 것을 확인하였다. 이는 국내 번식하는 노랑부리백로 집단이 중국에서 번식하는 집단과 유전적 교류가 있다고 판단되며, 번식시기보다는 월동지인 동남아시아 등지에서 모여 집단 월동할 가능성이 있다. 향후, 노랑부리백로 mtDNA와 STR genotyping의 분석을 추가적으로 수행하여 한국에서 번식하는 노랑부리백로의 유전자 다양도와 계통분석을 심층적으로 수행할 필요가 있다.
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