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Site-Directed Mutagenesis에 의한 야생형 연장된 치오레독신의 선택적 대량생성
사재훈,백혜승,이회봉,백융기,임창진,Sa, Jae-Hoon,Baek, Hye-Seung,Lee, Hee-Bong,Paik, Young-Ki,Lim, Chang-Jin 생화학분자생물학회 1992 한국생화학회지 Vol.25 No.6
An E. coli trxA mRNA contains two potential translation initiation codons, one of which initiate synthesis of a protein, called extended thioredoxin, 19 amino acid longer than thioredoxin. A mutant extended thioredoxin, which has leucine instead of methionine at its 20th position, was previously purified and charactered. In the present work, it was attempted to enhance the synthesis of wild-type extended thioredoxin without concomitant synthesis of thioredoxin. The Shine-Dalgarno (SD) sequence for the second ATG codon was changed to become non-functional by site-directed mutagenesis. The SD mutant trxA gene could normally produce wild-type extended thioredoxin but not thioredoxin. To increase the production of wild-type extended thioredoxin, the SD mutant trxA gene was put under T7 promoter. We could examine in vivo function of wild-type extended thioredoxin without interference of thioredoxin. Additionally, the selective overproduction of wild-type extended thioredoxin would make its purification much easier. 대장균 치오레독신 유전자의 mRNA는 108개의 아미노산으로 구성된 치오레독신과 그보다 19개의 아미노산이 긴 연장된 치오레독신을 합성할 수 있는 두개의 가능한 번역 개시코돈을 포함하고 있다. 두번째 개시코돈에 존재하는 methionine대신에 leucine으로 치환된 변이형 연장된 치오레독신이 정제되어 그 성질이 보고된 바 있으나, 아직 야생형 연장된 치오레독신의 특성에 관하여 알려진 바 없다. 본 연구에서는 치오레독신의 동시생성 없이 야생형 연장된 치오레독신의 합성을 증가시키기 위하여, 두번째 ATG codon에 대한 Shine-Dalgamo(SD) sequence를 site-directed mutagenesis에 의하여 기능을 못하도록 변화시켰다. 제조된 SD mutant 치오레독신 유전자를 T7 promoter vector로 subcloning하여 그 생성물을 확인하였고, 치오레독신의 간섭없이 야생형 연장된 치오레독신의 생체내 특성을 일부 파악하였다. 야생형 연장된 치오레독신의 선택적 대량생성은 이 단백질의 정제를 보다 용이하게 할 것이다.
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