Biofuel productions from macroalgae by co-fermentation and engineered yeasts

선우인영 부경대학교 대학원 2019 국내박사

According to population growth and industrialization, fossil fuels has been depleted and faced environmental problems such as energy shortages due to climate change and global warming. All the things considered, alternative, sustainable, efficient, cost-effective and clean burning energy source were needed for present and future demand. Macroalgae biomass may provide a viable alternative to fossil fuels with various advantages. Especially, waste seaweed cause the significant environmental and economical losses. This waste seaweed can be used as the biomass. Thus, in this study, waste seaweed or red seaweed was used as the biomass for optimization of pretreatment conditions and productions of biofuel. Pretreatment was carried out with (hyper) thermal acid hydrolysis and enzymatic saccharification under various conditions. Adaptive evolution for the increase uptake of specific monosaccharide or yeast engineering by CRISPR/Cas9 were applied in fermentation process enable to enhance the biofuels productivity and reduce the fermentation time. Thus, development of biofuels production processes from macroalgae was carried to require the energy demands. Ethanol production was performed using waste seaweed obtained from Gwangalli beach, Busan, Korea, after strong winds on January 15, 2015. Eleven types of seaweed were identified and the proportion of red, brown and green seaweed wastes were 26, 46 and 28%, respectively. Optimal pretreatment conditions were determined as 8% slurry content, 286 mM H2SO4 for 90 min at 121℃. Enzymatic saccharification with 16 unit/mL Celluclast 1.5 L and Viscozym L mixture at 45℃ for 48 h was carried out as optimal condition. A maximum monosaccharide concentration of 30.2 g/L was obtained and used to produce ethanol. Fermentation was performed with single or mixed yeasts of non-adapted and adapted Saccharomyces cerevisiae KCTC 1126 and Pichia angophorae KCTC 17574 to galactose and mannitol, respectively. The maximum ethanol concentration and yield of 13.5 g/L and YEtOH of 0.45 were obtained using co-culture of adapted S. cerevisiae and P. angophorae. Enhancement of galactose uptake for ethanol production from Kappaphycus alvarezii (red seaweed) was developed using CRISPR/Cas9 system. The optimal condition for thermal acid hydrolysis of 10%(w/v) K. alvarezii were 350 mM HNO3 at 121℃ for 60 min, which yielded 34.71 g/L of reducing sugar with negligible inhibitory compounds. Optimal enzyme saccharification was carried out with a 1:1 mixture of Viscozyme L and Celluclast 1.5 L with a maximum monosaccharide concentration of 7.29 g/L. Fermentation was carried out with K. alvarezii hydrolysate using wild-type (WT) S.cerevisiae CEN.PK2-1, overexpression of each GAL1, GAL7, GAL10 and PGM2 by CRISPR/Cas9. Among the various strains, overexpression of GAL1, GAL7 and GAL10 did not show the significant differences of ethanol production. However, PGM2 showed higher galactose uptake rate and produce the highest ethanol concentration. This observation is particular important in the biofuel production, because galactose is one of the abundant monosaccharide in seaweed biomass such as a K. alvarezii, red seaweed. Acetone-butanol-ethanol (ABE) was produced using waste seaweed from Gwangalli Beach, Busan, Korea. The waste seaweed had a fiber and carbohydrate, content of 48.34%; these are the main resources for ABE production. The optial conditions for obtaining monosaccharides based on hyper thermal acid hydrolysis of waste seaweed were slurry content of 8%, sulfuric acid concentration of 138 mM and treatement time 10 min. Enzymatic saccharification was performed using 16 unit/mL Viscozyme L, which showed the highest affinity (Km= 1.81 g/L). After pretreatment, 34.0 g/L monosaccharides were obtained. ABE fermentation was performed with single and sequential fermentation of Clostridium tyrobutyricum and Clostridium acetobutylicum; this fermentation was controlled pH from 6.0 to 4.5. A maximum ABE concentration of 12.5 g/L with YABE=0.37 was achieved using sequential fermentation. tyrobutyricum and C. acetobutylicum. Efficient ABE production from waste seaweed performed using pH controlled culture broth and sequential cell culture. 인구의 증가와 산업화에 따라 인류는 지난 100년간 화석연료를 사용하였으며, 에너지 고갈과 기후 변화에 따른 기상이변 및 지구온난화와 같은 환경문제에 직면해 있다. 이에 따라 지속 가능한 생물자원인 바이오매스 기반의 바이오연료 생산 연구 및 기술개발이 지속적으로 증가하고 있다. 그 중 3세대 바이오매스인 해조류는 육상계 바이오매스의 한계를 극복할 수 있는 차세대 바이오매스이다. 해조류를 이용한 바이오에너지의 생산은 삼면이 바다인 우리나라에 적합하며, 해조류가 성장하는 동안 이산화탄소를 소모하는 닫힌 탄소순환으로 이산화탄소 배출량 감소 등 생태계의 안정화에 기여한다. 특히 해양 폐기물 해조류는 부패로 인한 악취, 환경오염 및 입출항 선박의 스크루 감김에 의한 고장을 유발한다. 따라서 매년 해수욕장에서는 여름철 관광객유치를 위해 해양 폐기물 해조류를 수거 및 폐기 하는데 막대한 비용을 투자하고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 해조류 및 폐해조류를 바이오매스로 이용하여 전처리 조건 최적화와 아세톤-부탄올-에탄올 발효 또는 에탄올 발효를 실시하였다. 다양한 조건에서의 산 촉매 열 가수분해, 초고온 산 촉매 열 가수분해 및 효소 전처리를 통해 당화공정을 최적화 하였다. 발효과정에서 특정 당 순치 또는 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 변형 효모는 당 섭취의 개선을 통해 발효시간 단축 및 고 농도 에탄올 생산을 가능하게 하였다. 폐 해조류를 기질로 이용한 아세톤-부탄올-에탄올 생산최적화를 위해 초고온 열산 가수분해, Michaelis-Menten식을 통한 효소당화 분석 그리고 특정 당에 순치된 Clostridium tyrobutyricum과 Clostridium acetobutylicum의 순차 접종 발효가 pH 조절과 함께 진행되었다. 초고온 열산 가수분해 및 효소당화 후 34.0 g/L 의 단당을 확보하였다. C. tyrobutyricum 과 C. acetobutylicum 순차 접종 발효 결과, 12.5 g/L의 아세톤-부탄올-에탄올을 0.37의 수율로 생산하였다. 따라서 특정 당에 순치된 C. tyrobutyricum 과 C. acetobutylicum을 발효 조건에 맞는 환경에 순차적으로 접종하는 발효방법은 기존의 단일 발효보다 효과적임을 알 수 있다. 폐 해조류를 기질로 이용한 에탄올 생산 최적화를 위해 RSM을 이용한 산 촉매 열 가수분해결과 분석, 효소당화 그리고 특정 당에 순치된 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia angophorae를 이용한 단일 및 혼합발효를 진행하였다. 산 촉매 열 가수분해를 통해 30.2 g/L의 단당을 생산할 수 있었다. S. cerevisiae와 P. angophorae를 통한 에탄올 발효 결과 두 가지 균주를 모두 사용한 배지에서 가장 높은 에탄올인 13.5 g/L를 0.45의 수율로 생산하였다. 따라서 특정 당에 순치된 균주의 혼합발효는 단일 균주를 이용한 발효보다 에탄올 발효효율을 높였다. 해조류 중 홍조류인 Kapphaphycus alvarezii를 이용하여 다양한 산을 이용한 산 촉매 열 가수분해, 효소당화 및 CRISPR/Cas9을 통한 재조합 균주를 이용한 에탄올 발효에 대한 연구를 진행하였다. 다양한 산 중에서 질산으로 처리한 경우 높은 단당과 낮은 저해물질 생성으로 가장 효율적인 것을 보였다. 효소당화 후 42 g/L의 단당을 확보하였다. 갈락토오스의 발효 효율을 높이기 위해 Leloir pathway에 관여되는 GAL gene family의 GAL1, GAL7, GAL10 그리고 PGM2를 strong promotor를 CRISPR/Cas9을 이용하여 삽입하였다. 4가지 균주 중 PGM2를 과발현시킨 균주에서 나머지 GAL gene family들의 발현 양을 증가시키며 가장 높은 농도의 에탄올을 생산하는 것을 확인하였다.

Studies of bioethanol production and heavymetal adsorption using macroalgae

선우인영 부경대학교 과학기술융합전문대학원 2016 국내석사

해양거대조류를 이용한 바이오에탄올 생산 및 중금속 흡착 선 우 인 영 부경대학교 과학기술융합전문대학원 해양바이오융합과학전공 요 약 본 연구에서는 G. amansii, S. japonica 그리고 E. intestinalis를 이용하여 열 산 가수분해, 효소당화 그리고 3종의 균주로부터 바이오에탄올 생산의 최적조건을 확립하는 연구를 수행하였다. 또한 에탄올 생산 후 폐기되는 해조류를 재사용하여 도금공장에서 배출되는 폐수의 중금속을 흡착하는 연구를 진행하였다. 바이오에탄올 생산의 최적 조건은 G. amansii의 경우 8% (w/v) 슬러리와 0.1 N의 황산을 이용하여 121℃에서 90분간 열처리 후 Celluclast 1.5L과 Viscozyme L을 섞은 혼합효소를 이용한 조건에서, S. japonica와 E. intestinalis의 경우 8% (w/v) 슬러리와 0.18 N의 황산을 이용하여 121℃에서 60분간 열처리 후 S. japonica의 경우 Celluclast 1.5L과 Spirizyme Fuel의 혼합효소에서, 또한 E. intestinalis의 경우 Celluclast 1.5L과 Viscozyme L을 섞은 혼합효소를 이용하여 효소당화 한 결과 각 각 36.4 g/L, 29.9 g/L 그리고 20.6 g/L 의 monosaccharide를 얻었다. 에탄올 발효를 한 결과 G. amansii를 S. cerevisiae로 발효하여 14.8 g/L의 에탄올을 얻었으며, 생산수율(YEtOH)은 0.41로 나타났고, S. japonica를 P. angophorae로 발효하여 11.6 g/L의 에탄올을 얻었으며, YEtOH은 0.34를 나타났다. E. intestinalis를 C. lusitaniae로 발효하여 9.9 g/L의 에탄올을 얻었으며 YEtOH은 0.48을 얻었다. 이 결과로 홍조류에서 가장 높은 농도의 에탄올을 생산하였다. 이 후 Cr(Ⅲ), Ni(Ⅱ) 그리고 Cu(Ⅱ)가 함유된 폐수에 폐기되는 슬러리를 10에서 130 g/L로 조절하여 흡착 실험한 결과 세종의 해조류 모두 슬러리양을 증가시킬수록 흡착은 증가하는 것으로 나타났다. Cu(Ⅱ)의 경우 10 g/L의 G. amansii 폐 해조류 슬러리를 첨가하여도 85.2%의 흡착률을 보이며 가장 높은 친화도를 확인할 수 있었다. 또한 세 종의 폐 해조류 중 홍조류가 가장 높은 흡착능을 나타내었다. 이결과로서 홍조류가 바이오에탄올 및 바이오흡착에 가장 적합한 바이오매스라고 판단된다. 이전 실험에서 가장 많은 에탄올을 생산했던 홍조류 4종 (Gelidium amansii, Gracilaria verrucosa, Kappaphycus alvarezii 그리고 Eucheuma denticulatum)을 이용하여 바이오에탄올을 생산하는 실험을 진행하였다. 열 산 가수분해와 효소당화과정 이후, G. amansii, G. verrucosa, K. alvarezii 그리고 E. denticulatum로 부터 각 각 38.5 g/L, 39.9 g/L, 31.0 g/L 그리고 27.5 g/L의 단당을 얻었다. 에탄올 발효에는 고 농도의 galactose에 순치한 Saccharomyces cerevisiae KCCM 1129를 사용하였다. G. amansii, G. verrucosa, K. alvarezii 그리고 E. denticulatum을 통한 최종 에탄올 생산양은 각 각 18.8 g/L (YEtOH=0.49), 19.1 g/L(YEtOH=0.48), 14.5 g/L(YEtOH=0.47), 13.0 g/L(YEtOH=0.47)의 에탄올을 얻었다. 에탄올 생산 이후 남은 폐 해조류 슬러리를 이용 하여 Cd(II), Pb(II) 그리고 Cu(II)에 생물 흡착실험을 진행하였다. Langmuir 평형 모델을 이용하여 흡착능을 평가한 결과, Cu(II)가 세 종의 중금속 중 가장 높은 qmax 값과 전기음성도를 나타내며 폐해조류와 가장 높은 친화도를 보였다.