인간망막 내피세포주에서 고농도 포도당이 caspase-3 경로를 통해 세포자연사 유도

서은선 ( Eun Sun Seo ),채수철 ( Soo Chul Chae ),고은경 ( Eun Gyeong Kho ),이종빈 ( Jong Bin Lee ) 한국환경생물학회 2009 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.27 No.1

당뇨망막병증은 서구에서 성인들의 실명을 일으키는 원인이다. 당뇨병이 있을 때 고혈당증은 여러 세포 형태에서 세포자연사를 유도하지만 그 기작은 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구의 목적은 인간망막 내피세포에서 고혈당 포도당이 세포자연사에 미치는 영향에 대하여 알아보았다. 망막 내피세포는 5, 25, 50 mM 포도당이 포함된 IMDM 배지에서 37℃, 5% CO2 조정된 항온기에서 24, 36, 48시간 동안 배양하였다. 여러 농도의 포도당을 처리한 인간망막내피세포 형태의 특징은 위상차현미경으로 관찰하였고, 세포의 생존은 MTT assay를 통해 산정하였다. 고농도 포도당에서 활성산소종인 세포 내의 H2O2는 FOX II assay와 caspase-3 assay에 의한 세포자연사를 통해 측정하였다. 고농도의 포도당을 처리한 세포에서의 DNA 분절화는 아가로스 겔 전기영동을 통해 관찰하였다. 25, 50 mM 포도당을 포함한 배양액에 48시간 동안 배양한 세포는 형태가 변하고, 세포자연사에 의해 유도된 DNA 분절화를 관찰 할 수 있었다. 25, 50mM의 포도당에서 배양한 세포와 5 mM 포도당에서 24, 36, 48시간 배양한 세포와 비교했을 때 25, 50 mM에서 죽은 세포의 수가 더 많았다. 또한 과산화수소의 양과 caspase-3의 활성은 고농도 포도당을 처리한 세포에서 증가하였다. 결론적으로 고농도 포도당이 배양된 인간망막 내피세포에서 세포자연사를 유도하는 것을 증명하였고, 고혈당증의 유도로 caspase 활성에 의존적인 세포자연사는 증가하였다. 고농도의 포도당이 처리된 세포에서 활성산소종 유발과 caspase-3 활성간의 관계는 아직 조사되지 않았다. Diabetic Retinopathy (DR) is a leading cause of blindness among adults in the western countries. Hyperglycemia is a condition, that induces apoptotic cell death in a variety of cell types in diabetes, but the mechanism remains unclear. The aim of the study is to understand the effects of high Glucose on Human Retinal Endothelial Cells. Retinal endothelial cells were cultured in Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium (IMDM) containing 5, 25 and 50 mM Glu-cose, incubated for 24, 36 and 48 hours in humidified 5% CO2 incubator at 37℃. Human Retinal Endothelial Cell Line (HREC) were characterized for morphology with different treatment by phase contrast microscopic analysis. Number of dead and viable cells was counted by trypan blue exclusion and supported by MTT assay. The intracellular Hydrogen peroxide (H2O2), a Reactive Oxygen Species (ROS) generation in high glucose conditions was assessed by FOX II assay and apoptosis by caspase-3 assay. The high glucose treated cells undergoing DNA fragmentation was witnessed by Agarose gel electrophoresis. We found that the cells incubated with 25 and 50 mM glucose containing medium for 48 hours altered the morphology of the cell, induced apoptosis and DNA fragmentation. The dead cell number were high in 25 and 50 mM when compared to the cells incubated with 5 mM glucose for 24, 36, and 48 hours. Also, the H2O2 levels and the activity of caspase-3 were increased in high glucose treated cells. Conclusions/interpretation: Our results demonstrated that elevated glucose induces apoptosis in cultured HREC. The hyperglycemia-induced increase in apoptosis may be dependent on caspase activation. The association between ROS generation and caspase-3 activation on high glucose treated cells is yet to be investigated.

나린진(Naringin)의 CCl₄에 의한 급성 간독성 보호효과

채수철(Soo-Chul Chae),고은경(Eun-Gyeong Kho),최승현(Seung-Hyun Choi),유근창(Geun-Chang Ryu) 환경독성보건학회 2008 환경독성보건학회지 Vol.23 No.4

Naringin의 간손상에 대한 보호효과를 조사하기 위하여 Naringin을 3일간 전처리한 다음 사염화탄소로 간손상시킨 후 그 보호효과 및 작용기전을 규명하였다. 수컷 6주령 생쥐에 3일간 구강으로 Naringin을 전 처리한 다음 사염화탄소를 투여 후에 혈청 내 간손상 지표인 alanine aminotransferase와 aspartate aminotransferase 효소 활성도와 간세포의 지질과산화의 수준을 측정한 결과 사염화탄소에 의해 증가된 이러한 효소 활성도가 Naringin의 처리 농도에 의존적으로 감소하였다. 또한 사염화탄소를 처리한 군에 비하여 Naringin을 전처리한 군에서 처리 농도에 의존적으로 간독성 물질을 몸 밖으로 배출시키는 작용을 하는 글루타치온의 함량이 회복되었다. 그러나 Naringin을 단독으로 처리한 경우에는 해독관련 효소인 글루타치온의 활성에 별다른 영향이 없었다. 사염화탄소에 의한가논상시 세포사멸을 확인하기 위해 DNA fragmentation 방법으로 조사한 결과 Naringin을 전 처리한군에서 사염화탄소에 의해 유발된 DNA 손상이 처리 농도 의존적으로 감소하였다. 세포사멸 관련 caspase 효소 활성화가 사염화탄소에 유도된 간손상과 연관되는지를 알아보기 위하여 caspase-8, -3 활성을 측정한 결과 Naringin을 전 처리한군에서 사염화탄소로 유도하여 증가된 caspase-8, -3 활성을 감소시켰다. 이러한 보호효과의 작용기전을 규명하기 위해 사염화탄소의 간대사 과정에서 주로 관여하는 효소인 cytochrome P450 2El에 효소활성을 측정한 결과 Naringin의 처리 농도에 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 Naringin의 사염화탄소에 의해 유발된 간손상 보호효과는 간대사 효소활성의 감소와 세포사멸과 연관된 caspase-8, -3 활성 억제에 의해 작용할 것이라 사료된다. 결론적으로 Naringin은 해독작용을 담당하는 조직인 간의 보호 작용에 있어서 큰 효과를 보여 줄 것이라 시사할 수 있다. The protective effects of the Naringin, on carbon tetrachloride (CCl₄)-induced hepatotoxicity and the possible mechanisms involved in this protection were investigated in mice. Pretreatment with Naringin prior to the administration of CCl₄ significantly prevented an increase in serum alanine, aspartate aminotransferase activity and hepatic lipid peroxidation in a dose-dependent manner. In addition, pretreatment with Naringin also significantly prevented the depletion of glutathione (GSH) content in the livers of CCl₄-induced mice. However, reduced hepatic glutathione levels was unaffected by treatment with Naringin alone. In addition, Naringin prevented CCl₄-induced apoptosis and necrosis, as indicated by a liver DNA laddering. To determine whether caspase-8, -3 pathway involved in CCl₄-induced acute liver injury, caspase-8, -3 activities were tested by ELISA. Naringin attenuated CCl₄-induced caspase-8, -3 activities in mouse livers. CCl₄-induced hepatotoxicity was also prevented, as indicated by a liver histopathologic study. The effects of Naringin on the cytochrome P450 (CYP) 2El, the major isozyme involved in CCl₄ were also investigated. Treatment of mice with Naringin resulted in a significant decrease of the CYP2El-dependent hydroxylation and aniline in a dose-dependent manner. These findings suggest that protective effects of Naringin against the CCl₄-induced hepatotoxicity may be due to its ability to block CYP2El-mediated CCl4 bioactivation and that is also protects against caspase-8, -3 pathway mediated apoptosis.

Naringenin이 NF-κB, AP-1 억제를 통한 MMP-9 활성 및 발현 억제 효과

채수철 ( Soo Chul Chae ),고은경 ( Eun Gyeong Kho ),서은선 ( Eun Sun Seo ),유근창 ( Geun Chang Ryu ),나명석 ( Myung Suk Na ),김인숙 ( In Suk Kim ),이종빈 ( Jong Bin Lee ) 한국환경생물학회 2009 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.27 No.1

Naringenin은 flavonoid 구조의 감귤류 과피에 다량 함유되어 있으며 항암 및 항산화 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 HT-1080 섬유육종세포의 전이에 대한 영향을 조사하였다. 먼저 Naringenin이 암세포의 이동에 미치는 영향을 알아보기 위해 migration assay를 한 결과, Naringenin이 암세포의 이동을 농도 의존적으로 억제시켰다. 암의 전이에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질분해효소인 matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)의 활성도를 측정하기 위해 gelatin zymography를 한 결과, Naringenin이 PMA에 의해 증가된 MMP-9의 효소 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9와 TIMP-1의 유전자발현에 대한 Naringenin의 영향을 RT-PCR 방법으로 조사한 결과, Naringenin이 PMA에 의해 증가된 MMP-9의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으나 TIMP-1의 mRNA 발현에는 변화가 없었다. MMP-9 발현 감소에 관여하는 전사조절인자를 확인하기 위해 promoter assay를 한 결과, Naringenin이 PMA에 의해 증가된 MMP-9 및 NF-κB, AP-1의 promoter 활성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9의 전자조절인자인 NF-κB와 AP-1의 결합 활성도를 electrophoretic mobility shift assay로 확인한 결과 Naringenin이 PMA에 의해 증가된 NF-κB와 AP-1의 결합 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 결론적으로 Naringenin이 전사조절인자인 NF-κB와 AP-1의 활성을 억제함으로써 MMP-9의 유전자 발현 및 효소 활성을 억제하고 그 결과 암세포의 이동과 침윤을 억제하는 것을 알 수 있다. The chemopreventive effects of naringenin derived from citrus on tumor migration and the possible mechanisms involved in this protection were investigated in HT-1080 tumor cells. In this study, we found that naringenin reduced phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-enhanced matrix metalloproteinases (MMP)-9 activation in a dose-dependant manner and further inhibited HT-1080 cell migration. In addition, naringenin suppressed PMA-enhanced expression of MMP-9 protein, mRNA and transcription activity levels through suppression of nuclear factor κB (NF-κB) activation and activator protein-1 (AP-1) translocation without changing tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 level. Therefore, our results suggested that the inhibitory effects of naringenin on MMP-9 activation, relation of tumor migration in vitro possibly involve mechanisms related to its ability to suppress PMA-enhanced MMP-9 gene and protein expression through NF-κB activation and AP-1 translocation. Overall, naringenin may be a valuable anti-invasive drug candidate for cancer therapy.

H₂O₂에 의한 결막 세포주의 세포고사에서 녹차추출물 EGCG의 보호효과

박수경(Su Kyoung Park),채수철(Soo Chul Chae),고은경(Eun Gyeong Kho),유근창(Geun Chang Ryu),김재민(Jai Min Kim),나명석(Myung Suk Na),이종빈(Jong Bin Lee) 한국안광학회 2008 한국안광학회지 Vol.13 No.3