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OVCAR-3와 SKOV-3 난소암 세포주에서 Flow Cytometry를 이용한 Apoptosis와 p53 단백의 측정
윤주희 ( Yoon Joo Hee ),최운만 ( Choi Woon Min ),조윤성 ( Jo Yun Seong ),나종구 ( Rha Jong Gu ),한구택 ( Han Gu Taeg ) 대한산부인과학회 2003 Obstetrics & Gynecology Science Vol.46 No.7
OVCAR-3와 SKOV-3 난소암 세포주에서 taxol 투여에 의해 유발된 고사 (apoptosis)의 연구를 통하여 두가지 세포주들 사이의 p53의 발현과 세포사의 생물학적 기전을 알아보고자 본 연구를 수행하였다. RPMI 1640 배양액으로 배양한 OVCAR-3와 SKOV-3 난소암 세포주를 taxol (paclitaxel)을 투여하지 않은 대조군과 taxol을 24시간 및 48시간 동안 투여한 투여군으로 나누어 실험을 진행하였다. 수확한 세포들을 먼저 annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate)와 anti-cytokeratin 항체인 clone CAM5.2와 clone MNF116과 반응시킨 다음 세포들을 세척하고 p53 항체를 가하여 반응시켰다. 세포들을 세척한 후 FITC와 공유 결합된 goat anti-mouse (GAM) immunoglobulin G (IgG)-FITC (이하 GAM IgG-FITC) 및 GAM IgG-phycoerythrin (PE) 이차 항체와 반응시켜 염색하였으며, 이어서 propidium iodide (이하 PI)를 이용하여 DNA를 염색하였다. 세포들의 분석에는 488 ㎚의 레이저가 장착된 표준 FACScan flow cytometer로 측정하였다. Taxol을 투여한 후 SKOV-3와 OVCAR-3 세포주 모두에서 G_2M에 세포들이 정지된 것으로 보아 정지된 세포들이 궁극적으로는 세포사 과정으로 진입할 것으로 생각되었다. Cytokeratin과 annexin V 및 G_0G_1 전분기 분획으로 표현된 고사 분획의 출현이 OVCAR-3 세포주에 비해 SKOV-3 세포주에서 낮은 것은 SKOV-3 세포주의 taxol에 대한 낮은 감수성을 나타내는 결과로 생각되었다. SKOV-3 세포주에서 p53 발현은 관찰되지 않았고, G_0G_1 전분기 분획의 미미한 증가 및 cytokeratin과 annexin V으로 측정된 고사 분획의 변화가 관찰되지 않았다. OVCAR-3 세포주에서 p53이 taxol의 투여 여부와 관계없이 발현되었지만 투여 시간에 따른 증가는 관찰되지 않았던 점과 G_0G_1 전분기 분획과 cytokeratin과 annexin V으로 측정된 고사 분획의 완만한 증가로 미루어 볼 때 p53의 발현이 세포주기 변화와 G_2M 분기의 정지와 무관하였으나 고사의 출혈과 관련되어 있을 것으로 생각되었다. 이러한 관찰은 향후 종양으로부터 채취한 종양 세포 부유액에 항암 화학요법제를 투여한 후 유발되는 고사의 정도를 신속하고 정확한 flow cytometry로 측정함으로써 항암 화학요법제의 투여 전 감수성을 알아보는 검사법의 개발 가능성을 암시하는 것으로 생각되었다. Objective : Taxol (paclitaxel)-induced apoptosis was studied to understand their biological mechanism correlated with the expression of p53 in the SKOV-3 and OVCAR-3 ovarian cancer cell lines. Materials and Methods : The SKOV-3 and OVCAR-3 cell lines were cultured in RPMI 1640 medium without taxol (control group) and with taxol for 24 h and 48 h (experimental group). After harvest, the cells were stained with annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-cytokeratin antibodies (clone CAM5.2 and clone MNF116). They were washed and stained with p53 antibody. After then the secondary antibodies, i.e., FITC- or phycoerythrin (PE)-conjugated goal anti-mouse (GAM) immunoglobulin G (GAM IgG-FITC or GAM IgG-PE) were added in the cells and they were incubated in the dark. DNA of these cells were stained sequentially with propidium iodide (PI). Standard FASCcan equipped with a 499 ㎚ single laser was used for the analysis of these cells. Results : Both of SKOV-3 and OVCAR-3 cell lines were arrested in the G_2M phase after treatment of taxol, suggesting that these cells would eventually enter into the stage of cell death. Fractions of negative cytokeratin and positive annexin V and amount of sub-G_0G_1 fraction indicative of apototic fractions were lower in the SKOV-3 cell line compared with that in OVCAR-3 cell line, probably as a result of lower sensitivity of SKOV-3 cell line to the taxol. p53 expression were not detected in SKOV-3 cell line. On the basis of observed findings in SKOV-3 cell line and findings of high expressions of p53 regardless of taxol treatment, no increase in their expressions according to culturing time, and gradual increases in sub-G_0G_1 fractions and in fractions of negative cytokeratin and positive annexin V indicative of apoptosis in OVCAR-3 cell line, we concluded that the expression of p53 would not be associated with cell cycle changes and the arrest in the G_2M pahse but associated with the appearance of apotosis. Conclusion : Our results suggest that flow cytometric detection of the apoptotic fractions would be an effective, fast, and accurate method for the chemosensitivity test in tumor cells before the administration of anti-cancer drugs in gynecologic cancer patients.
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