된장으로부터 혈전용해능을 가진 Bacillus sp.의 분리 및 동정

김승호,최낙식,이우일,이종우,김동호,Kim, Seung-Ho,Choi, Nack-Shick,Lee, Woo-Yiel,Lee, Jong-Woo,Kim, Dong-Ho 한국미생물학회 1998 미생물학회지 Vol.34 No.3

우리 나라의 전통 대두발효식품인 된장으로부터 혈전용해능을 가진 미생물을 분리하였다. 그 중 5종류의 균주를 Bergey's manual of systematic bacteriology에 의거하여 동정한 결과 Bacillus sp. 균주로 밝혀졌다. 분리된 Bacillus 속 미생물을 효소 유도배지에서 배양한 결과 B. amyloliquefaciens는 2.46 plasmin unit/ml, B pantothenticus는 3.82 plasmin unit/ml 의 혈전용해능을 가지고 있었고, B. subtilis는 4.94 plasmin unti/ml의 높은 혈전용해효소 생산능을 보여주었다. 분리 균주에 의하여 생산된 세포외 단백질을 SDS-PAGE와 reverse fibrin zymogram 활성측정법에 의해 확인한 결과 각 균주별로 서로 다른 혈전용해효소가 생산되었음을 확인하였다. Various bacterial strains that secret extracellular fibrinolytic enzyme were screened from Doen-Jang, a traditional soybean fermented food in Korea. Five microbes of them were identified to be Bacillus sp. strains according to Bergey's manual of systematic bacteriology. The culture filtrates of B. amyloliquefaciens (2.46 plasmin unit/ml) and B. pantothenticus (3.82 plasmin unit/ml) showed a level of fibrinolytic activity that was about three times higher than that of plasmin 1.0 unit and Bacillus subtilis showed the highest fibrinolytic activity (4.94 plasmin unit/ml). All of the extracellular proteases showing the fibrinolytic activity are confirmed by SDS-PAGE followed by reverse fibrin zymogram activity assay and we proposed that some of the fibrinolytic enzymes from this work are novel enzymes.

하이드록실아민 절단을 이용한 재조합 인간 상피세포 성장인자의 제조

김선호(Sun-Ho Kim),이우일(Woo-Yiel Lee) 한국산학기술학회 2021 한국산학기술학회논문지 Vol.22 No.6

본 연구의 목적은 재조합 인간 상피세포 성장인자(hEGF)의 발현 확인 및 정제의 용이성을 위해 단백질의 N-말단에 융합된 부분을 제거하기위하여 기존의 고가의 효소를 사용하지 않고 간단한 화학처리로 융합 태그를 절단하면서도 여전히 친화성 크로마토그래피로 정제가 가능한 재조합 hEGF의 경제적이며 공정이 단순화된 제조법을 제공하는 것이다. 인간 상피세포 성장 인자는 인간 세포 성장 및 증식에 매우 중요한 호르몬이며 이 단백질에 대한 발현 및 정제에 관한 많은 연구가 보고 되었다. 본 연구에서는 hEGF 유전자를 대장균 코돈에 최적화 하였으며 N-말단에 Hydroxylamine에 의한 절단이 가능한 Asparagine과 Glycine이 발현되도록 포함하여 설계하였다. 제조한 DNA를 대장균 발현 벡터인 pRSET_A에 삽입하여 발현용 균주 BL21 (DE3)에 형질전환 시켰으며 재조합 융합 단백질은 대장균에서 샤페론 벡터 pG-Tf2와 성공적으로 공발현 되었다. 발현된 융합 단백질은 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피로 정제한후 Hydroxylamine으로 처리해 N-말단 융합부분을 제거하였으며 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. ELISA 분석 결과 재조합 EGF의 활성이 상업용 hEGF와 92% 이상 유사한 것으로 나타났으며 피부 섬유아세포의 세포증식을 촉진하는 것으로 확인 되었다. The purpose of this study was to provide an economical and easy preparation method for recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) without the need for an expensive enzyme to cleave the fusion part. However, the N-terminal fusion part is still useful for affinity chromatography. The hEGF is an important hormone in cell growth and proliferation in humans, and many studies on the expression and purification of this protein have been reported. In the present study, the hEGF gene was designed to be optimized with the E. coli codon usage preference and to contain Asn-Gly at the N-terminus of the protein. The gene was inserted into pRSET_A, an E. coli expression vector, and transformed into E. coli BL21 (DE3). The recombinant fusion protein was successfully co-expressed with pG-Tf2, a chaperone vector, in E. coli and purified by Ni-NTA column chromatography. The rhEGF was then released by hydroxylamine treatment and confirmed by SDS-PAGE. ELISA analysis showed that the activity of the free rhEGF was more than 92% similar to that of commercial EGF. The biological activity of the rhEGF was confirmed by a cell proliferation test with human skin fibroblasts.

An Efficient Method for Production of Extracellular Human Tissue Factor in Escherichia coli

Hwan Goo Yoo(유환구),Yang Jin Park(박양진),Woo-Yiel Lee(이우일) 한국생명과학회 2009 생명과학회지 Vol.19 No.5

인간조직인자는 혈액응고인자 factor VII 과 복합체를 형성하며 연속적인 혈액응고 연쇄반응을 촉매하는 효소 활성체이다. 복합체 형성에 필수적인 이 조직인자의 세포 외 부분이, 기존의 융합 단백질 및 히스티딘 말단이 없는 새로운 발현 벡터에 의해 대장균 내에서 과량 발현 되었다. 봉입체 형태로 발현된 재조합 인간조직인자는 DEAE-Sephacel 크로마토그라피 기술을 적용하여 분리, 정제 및 구조적 복원이 동시에 시도 되었다. 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE 분석에서 순수한 형태로 나타났으며, 생물학적 활성도 또한 기존의 조직인자와 거의 동등함을 보였다. 본 연구의 발현 및 정제 시스템은 이전의 보고에서 보여진 방법들에 비해 단백질 분해효소를 사용하지 않아 추가적인 크로마토그라피 과정이 필요 없어 좀 더 효율적이기 때문에 기존의 발현 시스템에 대해 대체할 수 있는 매우 유용한 방법으로 제공된다. Human Tissue factor is an essential enzyme activator that forms a catalytic complex with factor VII/VIIa, and catalyzes both the extrinsic and intrinsic blood coagulation cascades. The extracellular domain of human tissue factor is responsible for association with the biological partner. The efficient procedures for preparing biologically active human tissue factor are essential for the preclinical and clinical studies with coaguligands. An expression vector in Escherichia coli has been constructed to direct the production of extracellular human tissue factor without a fusion protein or a His? at the N-terminus. The recombinant human tissue factor was expressed in large amounts as a non-native state in E. coli. The recombinant protein was simply renatured during the DEAE-sephacel chromatographic purification procedure. Our expression and purification system does not require a protease treatment or an additional chromatographic step to remove a fusion contaminant, which provides a very useful alternative to conventional expression systems for the production of human tissue factor.

Aureobasidium Pullulans로부터 Maltotriose Polysaccharide의 효율적 생산에 관한 연구

강은하(Eun Ha Kang),윤지예(Ji-ye Yun),이슬기(Seul Ki Lee),이우일(Woo-Yiel Lee) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회 학술대회 Vol.2014 No.2

플루란(pullulan)은 Aureobasidium Pullulans 으로부터 생산되는 Starch의 일종으로 glucose 분자들이 각각 intramolecue ɑ-1,4 glucosidic bond, intermolecule ɑ-1,6 glucosidic bond 결합하여 maltotriose로 구성된 다당류 폴리머이다. 플루란은 1938년 발견된 이래로 화장품뿐만 아니라 의약품의 피복물질, 식품 첨가물 등 다양한 분야에서 각광을 받고 있으며, 바이오 플라스틱 및 포장재 등 많은 연구분야에 적용되고 있다. 특히, Aureobasidium Pullulans으로부터 직접적으로 대량생산하여 산업계의 원료물질로 사용되고 있다. 본 연구에서는 생산공정 단계 중 생산된 pullulan의 Decolorization을 위한 Charcoal 과정을 생략하기 위해 Vitamin C를 이용하여 Aureobasidium Pullulans의 균주를 변이시켜 본래 생성되었던 melanin을 억제함과 동시에 pH 및 기질의 양을 조절하여 pullulan의 효율적 생산 조건을 목적으로 연구를 진행하였다.

코돈 최적화 및 샤페론 공발현을 통한 활성 형태의 재조합 인간 상피세포성장인자의 발현

장은빈(Eun-Bin Jang),김준수(Jun Su Kim),이우일(Woo-Yiel Lee) 한국산학기술학회 2020 한국산학기술학회논문지 Vol.21 No.9

세포 분열 및 성장 촉진에 영향을 주는 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 다양한 의학적 용도를 갖고 있는 호르몬 단백질이다. 본 연구에서는 human EGF 유전자를 대장균 코돈에 최적화 하고 pRSET 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 구축하였다. Human EGF를 봉입체가 아닌 활성이 있는 형태로의 과량 발현을 위해 코돈의 최적화와 더불어 최초로 샤페론 공발현이 시도되었다. 발현된 Native protein 형태의 재조합 human EGF는 고순도로 정제하기 위해 Ion Exchange Chromatography를 2번 연속적으로 수행하여 순수 분리 정제되었고, ELISA 분석결과 99% 이상으로 재조합 EGF의 활성도가 상업용 EGF와 유사하게 나타났으며, 세포증식시험 결과 인간 재조합 EGF는 인체피부 섬유아세포의 세포증식을 촉진하는 것으로 확인 되었다. 본 연구의 인간 EGF 발현 시스템은 양적인 측면 뿐 아니라 성공적인 활성형태의 발현으로 추가적인 재접힘 과정 및 N 말단의 융합부분을 제거하기 위한 크로마토그래피 작업이 필요가 없다는 점에서 기존의 방법들에 대체 될 수 있는 효과적인 인간 EGF 발현 시스템을 제공하고 있다. Epidermal growth factor (EGF) is a hormone protein that affects cell growth and proliferation, and has various medical applications. In the present study, the gene of human EGF was codon-optimized with E. coli and the expression vector was constructed by cloning into pRSET. In order to obtain the recombinant human EGF in an active form rather than an inclusion body, chaperone co-expression was attempted along with codon optimization, for the first time. The expressed human EGF was isolated in the pure form by performing Ion Exchange Chromatography in two consecutive runs. ELISA analysis showed that the activity of purified EGF was greater than 99%, which is similar to commercially available EGF. Cell proliferation test confirmed that the recombinant human EGF has the ability to promote cell proliferation of human skin fibroblasts. The human EGF expression system of this study gives a significant amount of protein, and does not require the renaturation step and the additional chromatographic system to remove a fusion contaminant, thereby providing a very useful alternative to conventional expression systems for the preparation of recombinant human EGF.

Aureobasidium Pullulans 의 Melanin색소 억제에 대한 연구

전희수(Hee Soo Yun),윤지예(Ji-ye Yun),임재현(Jae hyun Lim),유환구(Whan Koo You),이우일(Woo-Yiel Lee) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회 학술대회 Vol.2014 No.2

플루란(pullulan)은 Aureobasidium Pullulans 으로부터 생산되는 Carbohydrate의 일종으로 glucose 분자들이 각각 α-1,4 및 α-1,6 glucosidic bond로 결합된 maltotriose를 구성성분으로 이루어진 다당류 폴리머이다. 플루란은 1938년 발견된 이래로 Aureobasidium Pullulans으로부터 직접적으로 대량생산하여 화장품뿐만 아니라 의약품의 피복물질, 식품 첨가물 바이오 플라스틱 및 포장재 등 다양한 분야의 산업계에서 주목을 받고 있는 실정이다. 본 연구에서는 charcoal을 이용한 Aureobasidium Pullulans으로부터 플루란을 생산하는 기존의 방식을 개선하기 위하여 Vitmin C 및 꽈리(Ground cherry) 추출물을 이용한 Aureobasidium Pullulans의 Melanin색소 억제를 시도 하였다. Melanin 색소가 억제된 균류로부터 플루란의 생산은 공정의 효율성과 생산 단가 절감의 차원에서 주목된다.

Evidence for Essential Histidine(s) in γ-Glutamyl Transpeptidase from Rat Kidney

Lee, Woo-Yiel,Kim, Soo-Ja 慶熙大學校 1988 論文集 Vol.17 No.-

쥐 신장에서 분리한 Υ-glutamyl transpeptidase는 중성 조건하에서 diethyl pyrocarbonate에 의해 빠르게 비활성화 되었으며, 이 반응의 2차 반응속도 상수는 3.8M M^-1S^-1였다. 이 비활성화 반응은 파장 240nm 에서 휴광도의 증가를 초래하며 기질인 glycylglycine의 존재하에서는 비활성화 반응속도가 크게 감소하였다. 또한 반응속도론지 상수 Vm/Km의 수소 이온 농도 효과로부터 이 효소분자의 한 기능적 이온화기의 pK_a가 7.1로 나타났으며 이들 결과들은 diethyl pyrocarbonate에 의해 변형된 가능기는 pK_a가 7.1인 histidine 잔기이며, 이 잔기는 이 효소의 촉매적 기능에 관여되는 것으로 추정된다.