The Efficient Gene Delivery into Human Mesenchymal Stem Cells Using Retroviral Vectors

김성수(Sung Soo Kim),김범준(Bum Jun Kim),서해영(Haeyoung Suh-Kim) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.5

사람의 중간엽 줄기세포 (human mesenchymal stem cell, hMSC)는 여러 중배엽 유래의 세포로 분화할 수 있는 다능성세 포로서, 저자 등은 시험관내에서 장기간 배양한 세포에 효과적으로 유전자를 전달할 수 있는 방법에 관해 연구하였다. 일반적인 방법에 의한 hMSC로의 유전자전달 효율은 5% 정도였고, 레트로바이러스를 이용할 경우 46%의 효율을 나타내었 다. 또한 반복적인 레트로바이러스 감염에 의해 유전자 전달효율은 90%로 향상되었고, 레트로바이러스 감염에 의한 세포 의 분화능력에는 변화가 없었다. 본 연구에서 설정된 방법은 hMSC를 이용한 trans-differentiation 방법의 개발 및 여러 질환치료 목적으로 자가이식이 가능한 세포의 공급원으로서 사용이 가능할 것으로 생각된다. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are multipotent stem cells that can differentiate into several mesenchymal lineage cells. In this study, we established an efficient method for gene delivery into these cells. Non-viral transfection reagents that were commercially available yielded 5% efficiency. In contrast, a retroviral vector yielded more than 46% transduction, which was further increased to 90% by repetitive infection. Retroviral transduction did not alter the multipotency of hMSCs. Thus, the cells retained the potential to differentiate into adipogenic, chondrogenic, or osteogenic lineages. The conditions established in this study will contribute to development of trans-differentiation methods of hMSCs into non-mesodermal lineage cells and thereby facilitate their possible use as vehicles for autologous transplantation in both cell and gene therapy for various diseases.

Goα를 영구적으로 발현하는 세포에서의 신경돌기 성장 억제

길성호(Sung-Ho Ghil),서해영(Haeyoung Suh-Kim) 대한해부학회 2002 Anatomy & Cell Biology Vol.35 No.2

G 단백질은 신경전달물질과 호르몬에 의해서 발생되는 신호를 세포내부로 중개하는 신호전달물질이다. G 단백질 중 Go 는 뇌조직의 막에 상당량 발현되는 단백질이지만, 아직까지 그 기능이 정확히 알려져 있지 않다. 본 연구팀은 선행연구에서 Go의 α 소단위체인 αo를 신경모세포종인 F11세포에 일시적으로 과발현시키면, 신경돌기의 형성에 큰 영향이 있음을 보고한바 있다. 본 연구에서는 이러한 변화가 유전자의 일시적 과발현에 의해서 생기는 비특이 적 현상인지, 아니면 αo에 의해서 일어나는 특이적 현상인지를 규명하기 위하여 F11 세포에 αo를 영구적으로 발현하는 세포를 제작한 후, αo가 지속적으로 발현될 때 신경세포의 분화과정에서의 변화를 조사하였다. αo의 야생형과 돌연변이형을 지속적으로 발현하는 F11 세포를 모두 제작하였다. 각 세포에 dibutyryl cAMP를 처리한 후 신경돌기의 길이를 측정하였다. 정상적인 F11 세포의 경우, 신경돌기의 길이는 57.9±7.0 μm이었으며, 야생형과 돌연변이 αo가 지속적으로 발현된 세포의 경우, 신경돌기의 길이는 각각 34.4±5.1 μm와 30.5±3.6 μm이었다. 이는 정상 F11 세포에 비하여 각각 40.6%, 47.3% 감소한 것으로서, αo가 지속적으로 발현되는 경우에, 일시 과발현되는 경우와 마찬가지로 신경세포의 분화과정 중 특히 신경돌기의 형성과정을 조절한다는 사실을 의미한다. 나아가 두 가지 다른 접근법에 의하여 동일한 결과를 얻었으므로 신경돌기 형성과정의 변화는 αo에 특이적으로 일어남을 알 수 있었다. Heterotrimeric G proteins mediate signals generated by neurotransmitters and hormones. Among G proteins, Go is found in a large quantity in brain and growth cone membranes of neurons. In spite of its abundance in neurons, the role of Go is not fully understood. In the previous study, we showed that transient expression of the α subunit of Go (αo) modulated neurite outgrowth in F11 cells. It is possible that transient transfection may cause transient accumulation of the protein, which itself may alter differentiation process in non-specific manner. In this study, we determined that modulation of neurite outgrowth by αo was specific by evaluating the effect of αo in stably transformed F11 cells. F11 cells stably expressing the wild type αo (αowt) and a constitutively active form of αo (αoQ205L) were established. In normal F11 cells and αo-stable cell lines, the neurite length was measured in the presence of dibutyryl cAMP. In normal F11 cells, the average length of neurites was 57.9±7.0 μm. In αowt- and αoQ205L-expressing cells, the average length were 34.4±5.1 μm 30.5±3.6 μm, respectively. Thus, stable expression of αowt and αoQ205L caused a decrease in neurite outgrowth by 40.6%, 47.3% respectively. This result indicates that modulation of neurite by αo was specific to the function of αo but not due to accumulation of exogenous proteins.

사람 중간엽줄기세포 성장에 미치는 basic fibroblast growth factor의 영향

김성수(Sung Soo Kim),최정원(Jung Won Choi),곽규범(Kyu Bum Kwack),이영돈(Young Don Lee),서해영(Haeyoung Suh-Kim) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.6

중간엽줄기세포는 중배엽유래의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 갖는 줄기세포로서 골수에서 쉽게 채취할 수 있다. 본 연구에서는 사람의 중간엽줄기세포를 시험관내에서 장기간 배양시 세포의 증식과 다분화능에 있어서 basic fibroblast growth factor (bFGF)의 영향을 조사하였다. 세포를 배양할 수 있는 최적의 조건을 설정하기 위하여 여러 성장인자를 시험하였다. Hepatic growth factor (HGF)와 leukemia inhibitory factor (LIF)는 골수에서 분리한 중간엽줄기세포의 증식에 별다른 영향을 주지 않았으나, bFGF는 시험관내에서 세포의 성장을 3배 정도 증가시켰으며, 그 효과에 있어서 bFGF의 농도가 10 ng/mL 이상인 경우에는 큰 차이가 없었다. 저연령층의 골수에서 추출한 중간엽줄기세포는 bFGF의 존재와 상관없이 지방세포, 뼈세포, 연골세포로 분화하는 잠재력을 유지하고 있었으며 CD9, CD13, CD15, CD90, CD137, CD140b에 양성이었고, CD14, CD34, CD45에는 음성이었으며, 정상적인 핵형을 유지하고 있었다. 반면에 고령의 공여자로부터 분리한 중간엽줄기세포는 bFGF가 없을 경우 지방세포로의 분화능이 현격히 낮았으나, bFGF가 있는 경우에는 지방세포 및 뼈세포로의 분화능이 유지되었다. 또한 bFGF가 첨가된 배양액에서 증식시킨 중간엽줄기세포는 미분화상태에서도 이미 신경줄기세포의 표지자인 nestin과 신경세포의 표지자인 β-tubulin III을 발현하고 있었다. 이러한 결과는 bFGF가 사람의 중간엽줄기세포의 증식과 다분화능을 유지시키는데 중요한 성장인자로 작용함을 의미하고 있다. 또한, 중간엽줄기세포를 신경계질환의 세포치료제로서 사용하기 위해서는 미분화상태와 신경세포로 분화된 후를 구별할 수 있는 새로운 표식인자가 필요함을 제시하고 있다. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are multipotent stem cells that can differentiate into several mesenchymal lineage cells. In this study, we established conditions that allowed a long term expansion of hMSCs. To search for the optimum culture condition, growth rates of hMSCs were measured in the presence of several growth factors. Hepatic growth factor (HGF) and leukemia inhibitory factor (LIF) did not facilitate proliferation of hMSCs. In contrast, basic fibroblast growth factor (bFGF) effectively promoted growth of the cells in vitro by 3 fold. The growth stimulatory effect of bFGF was dependent on the concentration. The adipogenic potential was dramatically decreased in hMSCs isolated from an aged donor whereas osteogenic potential was minimally decreased. Addition of bFGF resumed the adipogenic and osteogenic differentiation potential. Thus, the cells that expanded in the presence of bFGF retained the potential to differentiate into adipogenic, chondrogenic, or osteogenic lineage cells. MSCs could be expanded for at least 8 passages with bFGF and the resulting cells retained the normal karyotype. The cells were positive for CD9, CD13, CD15, CD90, CD137, and CD140b; but negative for CD14, CD34, and CD45. Importantly, the cells were found to express a neural stem cell marker, nestin, and a neuronal marker, β-tubulin III. The results suggest that bFGF promote proliferation while maintaining multi-lineage differentiation potency of hMSCs. Finally, we suggest that it is critical to identify novel markers other than nestin or β-tubulin III to monitor acquisition of neuronal phenotypes by hMSCs.

신경줄기세포의 냉동보관법 확립

권광원(Kwang Won Kwon),김미란(Mi Ran Kim),서해영(Haeyoung Suh-Kim),이영돈(Young Don Lee),김성수(Sung Soo Kim) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.6

신경줄기세포(neural stem cells)는 신경세포와 신경아교세포를 형성할 수 있는 능력을 가진 세포로서 발생중인 중추신경계뿐만 아니라 성인 뇌조직의 제한된 부위에서도 발견된다. 본 연구에서는 사람 신경줄기세포의 장기간 보존을 위하여 냉동보관 방법을 확립하였다. 또한 냉동보관된 태아 뇌조직으로부터 신경줄기세포를 분리, 배양할 수 있는 가능성을 조사하였다. 우선 신경줄기세포의 표지자로 알려진 nestin의 발현과 함께 green fluorescence protein (GFP)을 발현하는 형질전환 생쥐를 이용하여 신경구의 형태로 증식된 세포가 신경줄기세포임을 GFP 발현을 통해 확인하였다. 태아의 신경줄기세포는 신경구에서 nestin의 발현을 통해 확인하였고, 분화조건에서 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포로 분화하는 것으로 미루어 이들이 다분화능을 유지하고 있음을 확인하였다. 신경구를 냉동보관하고 해동시킨 후 다시 증식시켜 얻은 신경구의 분화능력은 냉동 전의 신경구와 차이를 나타내지 않았다. 또 임신 10~15주의 태아의 대뇌조직을 잘게 부수어 신경구와 동일한 방법으로 냉동보관한 후 이를 해동시켜 신경구의 형성을 유도한 경우에도 신경세포와 별아교세포로의 분화능력이 유지됨을 관찰하였다. 이는 조직에 남아있던 신경줄기세포가 생존하여 증식하였기 때문으로 추정된다. 본 연구의 결과는 뇌조직이나 대량 배양된 신경구를 장기간 냉동보관하여 필요한 시기에 해동, 배양하여 신경줄기세포의 이식에 사용할 수 있다는 가능성을 제시하고 있다. Neural stem cells are multipotent stem cells that can differentiate into neurons and glial cells. Neural stem cells are found in not only developing nervous system but some restricted regions in adult brain. Here, we presented an effective method that allows a long-term preservation of neural stem cells without losing multipotency. First, we isolated neural stem cells from the developing forebrain of nestin-EGFP transgenic mice carrying green fluorescence protein (GFP) driven by nestin promoter and enhancer. Primary neurospheres isolated from these mice highly expressed GFP. The expression of GFP in neurospheres was sustained for several passages. In order to investigate the effect of freezing on the stem cell properties, we cryopreserved the primary neurospheres for 2 wks in liquid nitrogen. GFP expression pattern as well as differentiation potential of the secondary neurosphere formed after cryopreservation were not that different from those of the primary neurosphere formed before cryopreservation. When the same cryopreservation method was applied to neural stem cells isolated from human fetal brain (gestation 13~15 wks), the expression of nestin, a stem cell marker, and differentiation patterns were not changed after cryopreservation. We also performed isolation of neural stem cells from long-term cryopreserved human fetal brain tissues. The neurospheres were successfully formed and showed similar differention properties with neurospheres isolated from fresh brain tissue. In addition, we demonstrated multipotentiality of neural stem cells was not changed with the duration of cryopreservation of brain tissue, suggesting the self renewality and multipotentiality of neural stem cells were not affected by long-term cryopreservation, The present results provide an useful information for the development of stem cell expansion which is essential factor in clinical application of stem cells.

Gene Expression of NeuroD/BETA2 during Development of the Mouse Central Nervous System

조장현(Jang-Hyeon Cho),황우섭(Woo-Sup Hwang),김연수(Yeon-Soo Kim),이영돈(Young-Don Lee),서해영( Haeyoung Suh-Kim) 대한해부학회 2000 Anatomy & Cell Biology Vol.33 No.1

basic helix-loop-helix 전사인자 (transcription factor)에 속하는 NeuroD/BETA2 유전자는 신경형성과정 중 종말분화에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 왔다. 신경계의 발생 및 분화과정에서 NeuroD/BETA2 유전자의 기능을 알기 위해서 본 연구에서는 생쥐의 배자발생과정, 출생초기 및 성숙한 생쥐를 대상으로 in situ hybridization방법을 이용하여 유전자의 발현 양상을 조사하였다. NeuroD/BETA2 유전자는 발생중인 생쥐의 신경계에서 매우 높게 발현되었다. 출생 초기에 NeuroD/BETA2 유전자는 소뇌 와 해마에서 시간이 경과할수록 지속적으로 증가하는 발현양상을 보여주었고 성숙 후에도 비교적 안정한 상태로 발현되었다. 출생 전 NeuroD/BETA2 유전자는 배자발생과정 동안 뇌실밑층의 분열을 마친 세포에서 발현되었다. 이러한 결과는 NeuroD/BETA2 유전자가 신경형성과정 중 종말분화과정에 중요한 역할을 담당한다는 사실을 확인시켜 준다. NeuroD/BETA2, a basic helix-loop-helix transcription factor, has been known to play a role in terminal differentiation during neurogenesis. To gain further insight into the function of NeuroD/BETA2 in the nervous system development, we examined the expression pattern of NeuroD/BETA2 during embryonic and postnatal development by in situ hybridization. Dynamic changes of NeuroD/BETA2 expression were observed in the developing nervous system. Gene expression of the NeuroD/BETA2 in developing cerebellum and hippocampus increased during the embryonic stages and persisted throughout postnatal development and remained at a stable level in the adult brain. NeuroD/ BETA2 expression was detected in postmitotic cells in the subventricular zone of the cerebrum during embryogenesis. This observation confirms that NeuroD/BETA2 may have a role in terminal differentiation during neurogenesis.

The Efficient Gene Delivery into Human Mesenchymal Stem Cells Using Retroviral Vectors

Kim, Sung Soo,Kim, Bum Jun,Suh-Kim, Haeyoung 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.5