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Cytochrome P450 Reductase가 인삼의 사포제닌 합성에 미치는 영향
반용욱 ( Yong Wook Ban ),최용의 ( Yong Eui Choi ) 한국임학회 2014 산림과학 공동학술대회 논문집 Vol.2014 No.-
이전 우리 실험실에서는 세가지의 CYP716A 그룹의 유전자(CYP716A47, CYP716A53V2, CYP716A52V2)를 규명하였다. P450 계열 물질의 합성 과정에서 Cytochrome P450 reductase(이하CPR)는 NADPH로부터 P450 물질까지 전자를 전달해주는 중요한 역할을 한다. 하지만 인삼의 CPR에 관한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구에서는 인삼에서 두 개의 CPR 유전자(pgCPR1, pgCPR2)를 규명하였다. pgCPR1과 pgCPR2의 full-length cDNA로 클로닝하였고, 아미노산 염기서열로 알아본 크기는 각각 709와 678로 나타났다. 또한, 이미 알려진 다른 식물의 CPR과 비교했을 때 30%~90%의 상동성을 갖고 있었다. pgCPR의 인삼 내에서의 발현량의 변화를 확인하기 위해 먼저 인삼의 뿌리에 Methyl Jasmonate(이하 MeJA)를 처리하여 RT-qPCR로 발현 차이를 확인하였다. 그 결과 무처리 인삼보다 처리된 인삼에서 pgCPR의 양이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 이스트 균주에 PNY1과 CYP716A52V2 그리고 pgCPR을 동시에 형질전환 하여 oleanolic acid의 양의 변화를 확인하였다. 그 결과, pgCPR이 함께 형질전환 되었을 경우에 oleanolic acid 양이 약 30% 더 증가한 것을 볼 수 있었다. 결과로 미루어 봤을 때, pgCPR은 인삼의 CYP 계열의 물질의 합성에 중요한 역할을 하고 있음을 확인 할 수 있었다. Previous studies in our laboratory chracterized Three CYP716A subfamily genes ( CYP716A47, CYP716A53V2 and CYP716A52V2). As an important component of P450 enzyme systems, cytochrome P450 reductase(CPR) plays an essential role in transferring electrons from NADPH to the P450-substrate complex. However, little information about CPR in Panax ginseng (pgCPR) has been reported. Herein, we report two cytochrome P450 reductase genes( pgCPR1, pgCPR2) isolated from Panax ginseng. A full-length cDNA of pgCPR1 and pgCPR2 were cloned. The open reading frames of the pgCPR1 and pgCPR2 genes encoded 709 and 678 amino acids respectively and shared about 30%~90% identities with other known CPRs. Roots of ginseng were treated with MeJA and the expression of studied genes were confirmed by RT-qPCR. The result showed that the roots treated with MeJA have higher pgCPR synthesis as compare to the control. transfection of yeast cells was carried out with PNY1, CYP716A52V2 and pgCPR. The successfully transfected cells showed 30% increased Oleanolic acid production as compared to the ones transfected with PNY1, CYP716A52V2 only. These results indicate that pgCPR is important for the development Panax ginseng and it may play an essential role in the activation of the CYP genes of Panax ginseng.
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전사체 분석을 통한 가시오갈피( Eleutherococcus senticosus) 사포닌 생합성에 관여하는 유전자 연구
황환수 ( Hwan Su Hwang ),이효신 ( Hyo Shin Lee ),김민준 ( Min Jun Kim ),반용욱 ( Yong Wook Ban ),최용의 ( Yong Eui Choi ) 한국임학회 2014 산림과학 공동학술대회 논문집 Vol.2014 No.-
가시오갈피는 두릅나무과에 속하며 약효가 우수한 중요한 목본 중 하나이다. 하지만 많은 약용성분을 갖고 있음에도 불구하고, 가시오갈피의 사포닌 생합성 경로에 관여하는 유전자에 관해서는 거의 연구가 진행되지 않았다. 본 연구에서는, Genome sequencer FLX Plus를 사용하여 평균 422 base길이의 sequence와 627,923개의 high-quality read를 생산했다. De novo assembly에서는 16,214개의 contig들과 57,594개의 singleton들을 포함하여 총 73,808개의 새로운 sequence들을 산출했으며, 그 중41,278 (55.9%)개의 시퀀스들은 BLAST 유사성에 의하여 주석이 달렸다. 이를 통하여, 사포닌 골격 합성에 관여한다고 알려진 isoprenoid 경로의 효소들을 Acetyl-CoA부터 β-Amyrin까지 전부 찾을 수 있었다. 추가적으로, 206개의 CYP(cytochrome P450)와 145개의 UGT(UDP-glycosyltransferase) sequence를 발견했으며, 그 중 몇몇은 사포닌의 골격을 다양한 사포닌으로 변환시킨다고 알려진 encode 효소들로 454 cDNA library에서 찾아졌다. 최종적으로, 네 개의 CYP450과 세 개의 UGT들이 methyl jasmonate(MeJA) 유도 실험과 Real-Time PCR 분석을 통해 사포닌 생합성에 관여한다고 여겨지는 후보 유전자들로서 선발되었다. 얻어진 454 expressed sequence tag(EST)들은 가시오갈피 유전체의 기능적인 연구와 사포닌 물질대사 연구에 중요한 기초로 제공될 것이다. Eleutherococcus senticosus is a highly valued woody medicinal plant belonging in the Araliacae family. Even though extensive research work has been carried out on this plant, till date there is no report is available on describing the advanced stages of saponin biosynthetic pathway. Hence, in this study, de novo sequencing was performed to select the candidate genes involved in saponin biosynthetic pathway. One-half 454 pyrosequencing run produced 627,923 high-quality reads with an average sequence length of 422 bases. De novo assembly generated 73,808 unique sequences including 16,214 contigs and 57,594 singletons. About 41,278(55.9%) unique sequences were annotated using BLAST similarity searches. 206 CYPs(cytochrome P450) and 145 UGTs(UDP-glycosyltransferase) involved in the saponin backbone synthesis were isolated. Based on the methyl jasmonate(MeJA) treatment and Real-Time PCR analysis, four CYP450 and three UGT were finally selected as candidate genes involved in the saponins biosynthetic pathway. The obtained 454 expressed sequence tags(ESTs) will pave the way to study the saponin biosynthetic pathways and functional genomics of Eleutherococcus senticosus.
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