Immunomodulatory Mechanisms of Human Dental Pulp Stem Cells

곽규환 경희대학교 치의학전문대학원 2019 국내박사

Stem cell therapy is promising method to treat injuries or disease. Among the several types of stem cells, categorized by their source, mesenchymal stem cells have been actively studied for application in clinic because of their regenerative property as well as their immunosuppressive function. It is feasible that cryopreserved mesenchymal stem cells could be allogeneically transplanted to HLA-mismatched recipient patients because of its immunosuppressive properties. In chapter 2, we tested human dental pulp stem cells (hDPSCs) in vitro effects on acute allogeneic immune responses to examine the possibility that hDPSCs may be used to regenerate pulp by allogeneic transplantation. Cells purified from human dental pulp had the phenotype of mesenchymal stem cells (MSCs). The mixed lymphocyte reaction (MLR) was suppressed by incubation with hDPSCs, and this effect was due to soluble factor(s) released from the hDPSCs rather than cell-to-cell contact. Transforming growth factor beta (TGF-) was the major soluble factor responsible for inhibiting the allogeneic proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The production of IgM and IgG by allogeneic activation of responder B lymphocytes was also completely abrogated by TGF- released from hDPSCs via IFN- in response to activation of the responder T lymphocytes. This study provides an insight into the potential clinical use of hDPSCs for allogeneic transplantation. In chapter 3, to help immunosuppressive ability of hDPSCs, we have examined the effect of progranulin (PGRN) on human T cell proliferation and its underlying mechanism. We show that PGRN inhibits the PHA-induced multiplication of T lymphocytes. It increases the number of iTregs when T lymphocytes are activated by PHA, but does not do so in the absence of PHA. PGRN-mediated inhibition of T lymphocyte proliferation, as well as the induction of iTregs, were completely reversed by a TGF- inhibitor or a Treg inhibitor. Our findings indicate that PGRN suppresses T lymphocyte proliferation by enhancing the formation of iTregs from activated T lymphocytes in response to TGF-. Based on our work, both of them have an immunomodulatory function but they present their ability different way. It may have the potential to overcome the current limitations of immune rejection and have great accomplishment in future stem cell therapeutics including allogeneic transplantation of dental pulp. 줄기세포를 이용한 치료법은 부상당하거나 질병에 걸렸을 때 사용할 수 있 을 것으로 생각되는 획기적인 치료방법이다. 줄기세포는 세포의 유래된 곳에 따라 몇가지 종류로 나뉘는데, 그 중 중간엽 줄기세포는 재생할 수 있는 능력뿐 아니라 면역억제 기능때문에 임상적으로 적용할 수 있을 것이라 생각되어 활발히 연구되고 있다. 중간엽 줄기세포의 면역억제능력 때문에 저온 보존된 중간엽 세포를 이용해 HLA 타입이 맞지 않는 환자에게 동종타가이식을 할 수 있을 것으로 생각된다. 제 2장에서는 동종타가이식을 통한 치수 재생에 인간 치아치수유래 줄기세 포를 이용할 수 있는지 알아보기 위해, 급성 동종 타가 면역 활성 시 치아치수유래 줄기세포의 효과를 실험실상에서 확인했다. 인간 치아치수로부터 분리한 세포는 중 간엽 줄기세포의 표현형을 나타냈다. 인간치아치수유래 줄기세포와 함께 배양했을 때, 혼합림프구반응이 억제되었고, 이러한 효과는 인간치아치수유래 줄기세포와 림 프구의 접촉에 의한 것이 아니고, 인간치아치수유래 줄기세포로부터 나오는 용해 인자(들)에 의해 나타났다. 동종타가반응에 의해 유도된 말초혈액 증식은 인간 치아 치수유래 줄기세포에 의해 억제되는데, 이 기전에 영향을 주는 주된 용해 인자는 Transforming growth factor beta (TGF-b) 였다. 반응 B 림프구를 동종타가반응으로 활성 화 시켜 생성된 IgM, IgG 또한 인간 치아치수유래 줄기세포에 의해 완전히 사라졌 는데, 이는 반응 T 림프구의 활성에 의해 나온 Interferon gamma (IFN-g)를 통한 인간 치아치수유래 줄기세포의 TGF-b의 방출에 의한 것이었다. 제 2장에서의 연구를 통 해, 인간 치아치수유래 줄기세포가 동종타가이식을 위해 임상적으로 쓰일 수 있는 가능성을 제시했다. 제 3장에서는 인간 치아치수유래 줄기세포를 동종타가이식 시켰을 때 나타날 수 있는 면역 거부 반응을 좀 더 낮춰줄 수 있는 물질에 대한 연구를 진행했다. 이러한 후보 물 질 중 Progranulin (PGRN)의 인간 면역 억제에 대한 연구와 그 작용 기전에 대한 연구를 진행했다. 이 연구에서 PGRN이 PHA에 의해 유도된 인간 T 림프구의 활성을 억제시키는 것을 확인하였다. PGRN은 PHA에 의해 T 림프구가 활성 되었을 때, 유도 조절 T세포 (iTregs)의 숫자를 증가시켰으나, PHA에 의해 T 림프구가 활성화되지 않았을 때는 유도 조절 T세 포의 수를 증가시키지 않았다. PGRN에 의한 인간 T 림프구의 활성 억제와 유 도 조절 T세포의 유도는 TGF-b 억제제 혹은 조절 T 림프구 억제제에 의해 완 전히 그 기능이 사라졌다. 제 3장의 연구에서는 PGRN이 활성화된 T 림프구에 서 나오는 TGF-b에 의해 조절 T 림프구의 형성을 촉진함으로 인간 T 림프구 의 활성을 억제 시킨다는 것을 알 수 있었다. 이 연구를 통해 인간 치아치수유래 줄기세포와 PGRN 모두 면역조절기 능을 가진다는 것을 알 수 있었으며, 이들이 각각 다른 기전으로 면역억제능력 을 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 면역 거부 반응에 대한 한계 점을 뛰어 넘을 수 있는 가능성을 제시해주었으며, 미래에 치수의 동종 타가 이식을 포함한 줄기세포 치료에도 많은 도움이 될 것으로 기대된다.

Epigallocatechin-3-gallate 농도에 따른 치주인대 세포의 생활력에 관한 연구

유은규 경희대학교 대학원 치의학과 치과소아학 전공 2012 국내석사

Preservation of the periodontal ligament cell viability on an avulsed tooth is very important to obtain the successful outcome of replantation. The purpose of this study was to evaluate the effect of EGCG as a storage media on the viability of human PDL cell from avulsed tooth. Human PDL cells were collected from the healthy premolar teeth extracted for orthodontic treatment. PDL cells were stored in the various concentration of EGCG in HBSS. Time interval was 0, 1, 3, 6, 12, 24hours. The viability of PDL cells were determined using MTS assay and Nucleocounter?? system. 1. The MTS assay analysis indicated that the viability of PDL cells in less than 5μM EGCG was similar with the HBSS Group in every time (P<0.05). As time increases, viabilities of PDL cells in 10, 20 and 50μM EGCG were decreased compared with the HBSS Group (P<0.05). Viabilities of PDL cells in 100μM EGCG and tap water were remarkably decreased (P<0.05). 2. The Nucleocounter?? system analysis showed that the survival rate of PDL cells in less than 20μM EGCG was similar with HBSS Group (P<0.05). The survival rate of PDL cells in 50μM EGCG was decreased as time passes more than 3 hours (P<0.05). Survival rates of PDL cells in 100μM EGCG and tap water were significantly decreased (P<0.05). 3. Results of the Nucleocounter?? system and MTS assay analysis were showed similar results and the viability and the survival rate of PDL cells in more than 50μM EGCG were decreased when stored more than 12 hours (P<0.05). In this study, it is evaluated that the administration of EGCG could influence on the cell viability and the proper concentration of the EGCG in the storage of PDL cells was predicted. Thus, further studies about the storage media using the HBSS containing less than 20 μM EGCG are needed to determine the maintenance of cell vitality, the anti-oxidant property, the anti-bacterial effect and the anti-inflammatory action.

(The) study of fractural behavior of repaired composite

박상순 경희대학교 대학원 치의학과 2010 국내석사

결함이 있는 복합 레진 수복물의 보존적인 치료 방법인 수리를 위하여 다양한 표면처리 방법이 제시되어 왔으며 대부분의 실험은 결합 강도 측정을 통해 그 효과를 입증했다. 수리된 수복물의 실패 원인이 계면의 결함에서 기인하는 경우 동일한 재료로 수리된 복합 레진의 결합부 파괴 거동을 평가하기 위해서는 파괴인성을 측정하는 것이 합당할 것이다. 이 연구는 복합 레진 수복물의 수리 시기와 표면 처리 방법에 따라 미세인장결합강도와 파괴인성을 측정, 비교하고 그 상관성을 평가하여 파괴 거동에 대해 알아보고자 시행하였다. 파괴인성 실험을 위한 60개의 short rod 시편과 미세인장결합강도를 위한 30개의 composite block을 만들었다. 표면 처리 방법 (none, sandblasting, diamond bur roughening)과 수리 시기 (fresh, 2주 시효)에 따라 6개 군으로 나누어 수리하고 24시간 후 미세인장결합강도와 파괴인성을 측정하였다. 측정된 값을 one-way ANOVA / Duncan test (α=0.05) 통계분석하고 FE-SEM으로 파괴인성 시편의 파단면을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 미세인장 결합강도는 fresh composite 군이 aged composite 군보다 통계학적으로 높게 측정되었다 (p < 0.05). 2. Fresh composite 의 수리에서, 표면 처리 방법에 따라 결합 강도의 차이는 없으나 aged composite은 기계적 표면 처리 방법에 의해 높은 결합 강도를 나타내었다 (p < 0.05). 3. 파괴인성 측정에서 기계적인 표면 처리는 수리 시기에 관계 없이 기계적인 표면 처리는 파괴인성을 증가시켰다 (p < 0.05). 4. 파괴인성은 미세인장결합강도와 유의한 상관관계를 가지나, 결정계수가 낮아 결합 강도가 파괴인성을 대신할 수는 없음을 알 수 있다 (r2 = 0.286). 5. FE-SEM 관찰을 통해 기계적 표면 처리를 하지 않았을 때는 접착층에서의 분리가, 기계적 표면 처리를 했을 때는 복합 레진 내에서의 분리가 두드러지게 관찰되었고 균열 편향 및 미세균열과 같은 균열 차폐 기전에 의한 복합 레진의 강인화를 확인할 수 있었다. 수복물의 탈락은 균열의 전도와 밀접한 관계가 있는 것으로 보이며 효과적인 복합 레진 수리를 위해서는 기계적 표면 처리가 더 중요하다. 이러한 파괴 거동의 연구에는 결합 강도와 더불어 파괴인성 측정을 병행하여 평가해야 할 것으로 사료된다.

Development of titanium surface treatments for biomedical applications : for biomedical applications

박세웅 경희대학교 치의학전문대학원 2017 국내박사

Two types of titanium surface treatment were investigated. One is deposition of Functionalized polymer nanolayer on the anodized titanium surfaces via intiated chemical vapor deposition (iCVD). The other is fabrication of Mesoporous TiO2 thin film for loading high dose drugs. First, Initiated chemical vapor deposition (iCVD) was utilized to generate a 200 nm thick, uniform, functionalized polymer nanolayer comprised of glycidyl methacrylate (GMA) on the surface of titanium implants as a means to improve cellular attachment. Dot-patterned GMA-coated specimens were prepared as well as fully coated specimens. In vitro cellular responses, including cell morphology, protein adsorption, cell proliferation assays, alkaline phosphate activity (ALP) assays, and calcium deposition assays were studied using adipose derived stem cells. The mechanical stability of the thin film was investigated by XPS and FE-SEM analysis of the GMA-coated implant after implantation to an extracted bone from a pig. The GMA-coated specimens displayed increased protein adsorption, higher alkaline phosphatase activities, and higher calcium deposition as compared to control sample with no cytotoxicity. Additionally, no defect was observed in the test of mechanical stability. Notably, dot-patterned GMA-coated samples displayed higher alkaline phosphatase activities than others. Functionalized polymer nanolayer deposition via iCVD is a flexible and robust technique capable of mass production of biocompatible layers. These properties make this technique very suitable for implant applications in a variety of ways. Second, we have fabricated mesoporous thin films composed of TiO2 nanoparticles on anodized titanium implant surfaces for loading drugs at high doses. Surface anodization followed by treatment with TiO2 paste leads to the formation of mechanically stable mesoporous thin films with controllable thickness. A series of antibacterial agents (silver nanoparticles, cephalothin, minocycline, and amoxicillin) were loaded into the mesoporous thin films and their antibacterial activities were evaluated against five bacterial species including three oral pathogens. Additionally, two agents (silver nanoparticles and minocycline) were loaded together on the thin film and tested for antibacterial effectiveness. The combination of silver nanoparticles and minocycline was found to display a wide range of effectiveness against all tested bacteria. 1952년 Brånemark 박사에 의하여 임플란트가 개발된 후, 임플란트는 의학/치의학계에서 매우 널리 사용되고있다. 많은 종류의 표면처리 방법이 개발되었지만, 즉시 식립과 즉시 부하 가능한 임플란트를 만들기 위해서는 더 빠른 골유착의 유도가 필요하다. 또한 임플란트의 성공률을 저해하는 임플란트 주위염을 방지할 수 있다면 임플란트 성공률을 더 높게 끌어올릴 수 있다. 본 연구에서는 2가지의 임플란트 표면처리 기술을 개발하였다. 첫번째는 개시화학증착법(iCVD)를 통하여 기능성 고분자 박막을 증착하는 기술이고, 다른 하나는 다공성 이산화티타늄 박막을 이용하고 고용량의 약물을 탑재할수 있는 기술이다. 먼저, 첫번째 연구는 개시 화학 증착법(initiated chemical vapor deposition, iCVD)을 이용하여 임플란트 표면에 균일한 나노층의 기능성 고분자를 증착함으로써, 세포의 부착과 분화를 증진 시켜 빠른 임플란트의 골유착을 유도하고, 다양한 기능성 고분자의 증착 가능성을 확인하는 연구이다. 티타늄 디스크에 양극산화 처리하여 표면의 거칠기를 증가시킨 후, 개시 화학 증착법을 통해 균일한 기능성 고분자 나노층(수십~수백 나노미터)을 증착한다. 본 연구에서는 세포의 부착을 증진시키기 위해 에폭시기를 포함한 Glycydyl methacrylate(GMA)를 100 nm 증착하였다. 양극산화 처리를 한 샘플 (ANOD), GMA 고분자 나노층을 코팅한 샘플 (GMA-full) 그리고 GMA를 점 패턴으로 코팅한 샘플 (GMA-dot)을 제작하였다. 표면 특성분석을 위해 IR, SEM, 접촉각 측정을 하였고, 세포실험은 지방유래 줄기세포로 진행하였으며, 단백질 흡착 실험, 세포증식 실험, 알카라인 포스파타제 활성도 실험, 알리자린 레드 염색 실험을 진행하였다. 또한 고분자 박막의 안정성을 확인하기 위해서 임플란트 식립 전후의 표면상태를 XPS와 SEM으로 분석하였다. GMA 고분자 나노층을 코팅한 샘플 (GMA-full)에서 높은 단백질 흡착율을 보였으며, GMA 고분자 나노층을 코팅한 샘플 (GMA-full)과 GMA를 점 패턴으로 코팅한 샘플 (GMA-dot)에서 골분화와 미네랄 양의 지표를 나타내는 알카라인 포스페이트 활성과 알리자린 레드 염색에서 높은 수치를 나타내었다. 특히 알카라인 포스페이트 활성도 실험에서 GMA를 점 패턴으로 코팅한 샘플 (GMA-dot)이 높은 수치를 나타내었다. 또한 고분자 박막의 기계적 안정성을 확인한 결과, 임플란트 식립 전후의 차이가 없음을 확인하였다. 세포실험(in vitro) 결과, GMA를 iCVD로 증착한 샘플이 그렇지 않은 샘플보다 증진된 골분화를 나타내었다. iCVD를 이용한 기능성 고분자 증착 기술은, GMA를 통한 세포 부착 및 분화 증진뿐 아니라, 나아가서 임플란트 주위염 예방과 임플란트의 탄성층 부여를 가능하게 할 수 있다. 두번째 연구는 다량의 약물을 탑재하기 위해서 다공성 이산화 티타늄 박막 플랫폼을 개발하는 것이다. 먼저 티타늄 디스크에 양극산화 처리를 하여 표면거칠기를 증가시키고 이산화티타늄 나노입자를 소결시킬 수 있는 기판을 제작하였다. 이산화티타늄 나노입자를 페이스트형태로 분산, 코팅한 후에 소결하여 견고한 다공성 박막을 얻었다. 4가지의 항생약물 (은나노입자, 세팔로신, 미노사이클린, 아목시실린)을 다공성 박막에 탑재한 후, 탑재량, 방출 특성 및 항균 특성을 확인하였다. 또한 두가지의 항생약물을 동시에 탑재하여 효과를 확인하였다. 평평한 기판에 비해 80~200배의 약물을 탑재할 수 있었고, 5가지 세균의 항생효과 실험결과 높은 항생효과를 보였다. 개발된 다공성 박막은 항생약물뿐 아니라 다양한 약물을 다량으로 탑재할 수 있는 플랫폼으로 사용할 수 있다.

Effects of bioactive glass-containing ionomer cement on dentin remineralization

배한얼 경희대학교 치의학대학원 2020 국내박사

연구목적: 본 연구는 bioactive glass (BAG)를 포함한 glass ionomer cement (GIC) 가 상아질 재광화에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 연구 재료 및 방법: 84개의 발거된 사람 소구치와 BAG (63S BAG; Bonding Chemical), GIC (Fuji IX, GC)를 사용하였다. GIC의 powder에 BAG의 함량을 다르게 첨가하여 4개의 실험군을 설정하였다; 1) BG0 군: 0 wt% BAG, 2) BG5 군: 5 wt% BAG, 3) BG10 군: 10 wt% BAG, 4) BG20 군: 20 wt% BAG. GIC의 표면 분석을 위해 각 군의 GIC block을 제작하고 이를 인공 타액에 2주간 보관한 후, FE-SEM으로 관찰하였다. 이후 상아질의 재광화를 확인하기 위해 치아의 상아질을 노출시키고 탈회하였다. 각 군별로 GIC block을 제작하여 이를 탈회된 상아질에 고정하고 인공 타액에 2주간 보관한 후, FE-SEM으로 관찰하였다. 탈회된 상아질 표면의 화학적 변화를 관찰하기 위해 동일한 방법으로 시편을 제작 및 처리하고 XRD로 3회의 표면 분석을 시행하였다 (탈회 전, 탈회 후, GIC 적용 후). BAG가 상아질에 대한 GIC의 결합 강도에 미치는 영향을 평가하기 위해 전단결합강도 측정을 시행하였다. 연구결과: FE-SEM 관찰에서 BAG의 함량이 증가할수록 GIC 표면에 무정형의 침착물 형성이 명확하게 관찰되었다. 또한 탈회된 상아질 표면과 개방된 상아 세관에서도 유사한 물질의 침착이 관찰되었다. XRD 분석 결과 대조군인 BG0 군의 경우 GIC 처리 후에도 수산회인회석 peak의 변화가 관찰되지 않았지만, BG5, BG10, BG20 군의 경우 수산화인회석 peak가 확인되었다. BG10, BG20 군의 경우 BG5 군에 비해 수산회인회석 peak가 더 명확하게 관찰되었다. 또한 각 군의 전단결합강도에는 유의성 있는 차이가 없었다 (p>0.05). 결론: BAG를 포함한 GIC는 결합강도를 저해하지 않으며, 탈회된 상아질을 재광화 할 수 있었다. 상아질 재광화 효과는 BAG의 첨가량이 증가할수록 명확하게 나타났다. 이러한 결과는 BAG를 포함한 GIC의 임상적 적용에 대한 가능성을 시사한다.

아동의 두개안면 심도와 고도의 성장변화에 관한 선계측적 연구

배영수 경희대학교 대학원 치의학과 교정학전공 1978 국내석사

항암제 5-fluorouracil이 발치창치유에 미치는 영향에 관한 실험적 연구

김판식 경희대학교 대학원 치의학과 구강외과학전공 1979 국내석사

흡연이 구강점막에 미치는 영향에 관한 세포학적 연구

전병진 경희대학교 대학원 치의학과 구강해부학전공 1980 국내석사

치근 섬유아세포에 대한 은-파라디움 합금의 세포독성에 관한 실험적 연구

윤인탁 경희대학교 대학원 치의학과 보철학전공 1983 국내박사

치경부 마모증에 관한 역학적 연구

김해균 경희대학교 대학원 치의학과 예방치과학전공 1979 국내석사