Substance P inhibits TNCB-induced atopic dermatitis in NC/Nga mice by restoring normal skin architecture

최형원 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내박사

The efficacy of substance P (SP) in atopic dermatitis (AD) using 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB)-induced NC/Nga mice were examined. The topical application of SP significantly alleviated clinical symptoms of AD in a TNCB-induced NC/Nga mice model, which was nullified by pre-treatment with NK-1R antagonist CP99994. SP treatment reduced the levels of inflammatory cytokines such as TNF-α, TSLP, and TARC, the infiltration of mast cells and their degranulation, CD3 T cells in atopic skin, and immune cell activity in axillary lymph nodes (aLNs), mesenteric lymph nodes (mLNs), and the spleen. Moreover, SP restored normal skin architecture by decreasing and confining Ki-67-positive proliferating cells to the basal cell layer, decreasing abnormal-type keratins as well as the expression of K6/16 and K17, increasing proteins associated with normal differentiation such as involucrin, filaggrin, and claudin-1, and reconstituting the basement membrane and collagen deposition. Furthermore, SP markedly reduced the expression of NGF and PGP9.5-positive itch-evoking nerve fibers in the epidermis and elevated the level of Sema3A. SP’s effect on keratinocyte differentiation and Sema3a expression was also confirmed in cultured human and mouse keratinocytes. Therefore, these results suggest that topically administered SP may be proposed as a potential medication for AD.

Spinasterol-Glucose and its synthetic derivatives attenuate inflammatory response in HaCaT keratinocytes and in DNCB-induced mouse model

정미라 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내박사

Atopic dermatitis (AD) is a chronic and complex inflammatory skin disease that caused by environmental effects, abnormal immunologic responses or dilapidation skin-barrier function. Keratinocytes are predominant cell type in the skin and play a pivotal role in producing various proinflammatory cytokines and chemokines, leading to development of AD. Since AD is kind of allergic inflammatory disease, production of Th2-type chemokines is closely related to the severity of disease. Chemokines, a family of small cytokines are crucial for recruitment of various immune cells like dendritic cells, lymphocytes and macrophage cells to inflammatory lesions. In AD patients, the expression of TARC and MDC was significantly higher in the lesional skin than healthy skin. Previously, we have shown that a phytosterol derivative, 3-O-β-D-glucopyanosylspinasterol (spinasterol-Glc) isolated from leaves of Stewartia koreana was reported to inhibit LPS-induced cytokine production in Raw 264.7 macrophage cells. In the present study, we investigated the effect of spinasterol-Glc on TNF-α/IFN-γ-induced expression of TARC and MDC in human HaCaT keratinocytes. Spinasterol-Glc inhibited both the mRNA and protein expressions of TARC and MDC induced by TNF-α/IFN-γ in a dose-dependent manner by blocking NF-kB and STAT signaling pathway. However since it is difficult to be available in large quantities of spinasterol-Glc from natural plants, we evaluated that spinasterol-Glc is uneconomical despite of its remarkable anti-inflammatory effects. Accordingly, we developed the analogue of spinastrol-Glc, DHE-Glc which is structurally similar to spinaterol, carrying same backbone and different side chain with spnasterol. Then, we determined whether this analogue show inhibitory effects on TNF-α/IFN-γ induced AD-like skin lesions similar with spinasterol-Glc. Pretreatment of DHE-Glc inhibited expression of TARC and MDC in TNF-α/IFN-γ stimulated HaCaT keratinocytes. Additionally, topical administration of DHE-Glc suppressed serum IgE and histamine levels as well as epidermal thickening and mast cell populations in 1-chloro-2,4-dinitrobenzene induced atopic dermatitis-like mouse skin. In summary, spinasterol-Glc and the synthetic derivative, DHE-Glc suppressed TNF-α/IFN-γ stimulated production of TARC and MDC in HaCaT cells and additionally, DHE-Glc reduced DNCB-induced AD-like symtoms of skin inflammation. These results suggest spinasterol-Glc and DHE-Glc may be used as a potential anti-inflammatory agent for the prevention and treatment of skin inflammatory diseases 아토피염은 대표적인 피부염증으로 환경적 변화 및 잘못된 면역반응, 피부장벽의 이상 등의 복합적인 이유로 유도되는 대표적인 피부질환입니다. 각질형성세포는 피부층의 대부분을 차지하고 있는 주성분으로서 아토피염 발병에 관여하는 다양한 염증성 사이토카인 및 케모카인을 생성해낸다. 케모카인은 작은분자량을 갖는 사이토카인의 일종으로 주화성을 담당해 염증반응을 유도하는 신호를 전달하는 물질들이며, 수지상세포, 백혈구를 비롯한 다양한 면역세포를 병변부위를 불러모으는데 중요한 역할을 한다. 특히나 아토피염이 유도가 되면 Th2성 케모카인들은 과발현되는데 대표적인 Th2 케모카인으로는 TARC, MDC가 있다. 실제 피부염 환자 혈청 내에는 TARC, MDC의 농도가 일반 건강한 피부에서보다 훨씬 높다. 앞선연구에서 우리는 노각나무 추출물의 주 구성분인 3-O-β-D-glucopyanosylspinasterol이 LPS로 염증이 유도된 대식세포 내에 방출되는 염증성 사이토카인의 생성량을 감소시켜주는 실험결과를 통해 이들물질이 항염증활성이 뛰어남을 밝혔다. 이번연구를 통해 spinasterol-Glc이 피부염증에는 어떠한 효과를 가지는지를 알아보고자 하였다. Spinasterol-Glc는 각질형성세포 내 TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가되는 TARC, MDC 발현량에 현저한 감소효과를 보였다. 그 다음, 이러한 항염증 활성은 중요 전사조절인자인 NF-kB와 STAT의 활성을 저해함으로써 이루어짐을 알아냈다. 그러나, Spinasterol-Glc는 대량생산이 어려워 경제성이 없음을 확인한 바, 대체물질로써 쉽게 얻을 수 있는 물질을 이용해 이들과 유사구조를 갖는 물질을 합성을 하였다. 우리는 Spinaterol의 합성 파생물질인 DHE-Glc이 피부염증에 있어 Spinasterol-Glc와 비슷한 효능을 보이는지 알아보고자 하였다. 그 결과, DHE-Glc 역시 TNF-α와 IFN-γ에 염증이 유도된 각질형성세포 내 증가되는 TARC, MDC의 생성량을 농도의존적으로 줄여주었다. 이후, in vitro상의 결과가 in vivo상에서도 적용가능한지를 알아보고자 동물실험을 수행하였다. DHE-Glc의 국소적 도포는 DNCB로 접촉성 피부염이 유발된 동물모델에서 피부염증 시 발생하는 임상적 특징 및 면역반응을 상당히 많이 감소시킴을 확인하였다. 혈청 내 igE 및 histamine의 생성량을 물론 피부층의 두께와 염증세포의 침윤 모두 DHE-Glc의 도포에 의해 상당히 감소되며 4mg/kg의 DHE-Glc가 포함된 크림 도포시엔 거의 정상군과 비슷한 정도로 염증이 완화됨을 확인할 수 있다. 지금까지의 연구결과를 통해 Spinasterol 과 그의 합성 파생물질인 DHE-Glc는 피부염증 치료제로도 잠재적인 효과가 있음을 짐작할 수 있다. 본 바대로 실험이 계획대로 잘 진행된 바, 좋은 결과를 이끌어 냈다고 생각한다. 또한 본 연구 결과는 아직 밝혀지지 않은 새로운 물질의 피부염증에 있어서의 약리효과 및 약물의 작용기전을 밝힐 수 있는 주요 연구 성과로 여겨진다.

Effect of High Hydrostatic Pressure Treatment on Conventional Hydroxypropylation of starch

천의현 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내석사

본 연구에서는 종래의 하이드록시프로필화 조건에 초고압을 병행처리하여 치환도와 pasting 특성에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 일반적인 방법의 (5, 10, 15, 20, 24시간, 45oC) 하이드록시프로필화 ‘Con’그룹과 초고압(400 MPa, 15 분)을 전처리 한 후 하이드록시프로필화를 거친 ‘HHP-Con’그룹, 하이드록시프로필화 이후 초고압처리를 거친 ‘Con-HHP’그룹을 각 조건에 따라 제조하였다. 모든 그룹에서 열처리 시간이 증가할수록 치환도 값이 증가하는 일반적인 하이드록시프로필화 전분의 특징이 나타났다. 그룹간의 치환도 차이는 15시간의 반응에서 가장 큰 차이가 나타났으며, 15HHP-Con은 상대적으로 높은 치환도를 갖고 15Con-HHP는 상대적으로 낮은 치환도를 갖는 것으로 나타났다. 반면, 20시간 이후로는 Con 그룹에 비하여 낮은 치환도 값을 나타내어 초고압의 영향이 크지 않은 것으로 나타났다. 투과율 결과에서는 15Con-HHP는 낮은 치환도를 갖고 있음에도 paste clarity 측정 결과 상대적으로 높은 투과율을 나타내어 치환도와 투과율의 비례적 상관관계와는 상이한 결과가 나타났다. Swelling power와 solubility는 열처리 시간이 증가할수록 증가하는 경향이 나타났으며, 열처리시간이 10 시간 이하일때는 큰 차이가 없었으나, 15시간 이후로 초고압 후처리 그룹에서 높은 값을 나타내었다. RVA Pasting 특성 결과에서는 전반적으로 초고압 후 처리(Con-HHP) 그룹들이 일반 타 그룹에 비하여 낮은 pasting temperature와 높은 break down, peak viscosity를 나타내었다. 이는 하이드록시프로필화 과정에서 hydrophilic하고 bulky한 하이드록시프로필기가 그래뉼 내부의 결합력을 약하게 만들었고, 초고압 처리에 의해 그래뉼의 붕괴현상과 hydration에 의한 침출현상이 촉진되어진 것으로 보인다. 이러한 메커니즘을 통한 치환도와 pasting 특성의 변화는 초고압 처리와 종래의 하이드록시프로필화 변성이 융합된 이중 변성 전분으로서의 식품 산업적 활용이 기대된다. In the present study, corn starch was treated with conventional hydroxypropylation conditions in combination with high hydrostatic pressure (HHP) and the effects of the HHP treatment on physicochemical properties of the starches were examined. A conventional hydroxypropylation (5, 10, 15, 20, 24hours, 45oC) ‘Con’ group, a ‘HHP-Con’ group that underwent a pretreatment by HHP (400 MPa, 15 minutes) followed by hydroxypropylation, and a ‘Con-HHP’ group that underwent hydroxypropylation followed by HHP treatment were made under their respective conditions. The characteristic of conventional hydroxypropylated starch in which the value of the degree of substitution (DS) increases along with reaction time appeared in all the groups. The largest difference in the DS among the groups appeared at reactions for 15 hours. The 15HHP-Con group was shown to have relatively high DS while the 15Con-HHP group was shown to have relatively low DS. On the other hand, when reaction time exceeded 20 hours, the HHP-Con group and the Con-HHP group showed lower DS compared to the Con group indicating that the effects of HHP were not great. Although the 15Con-HHP group had low DS, it showed relatively high transmittance in paste clarity. Swelling power and solubility increased with increasing reaction time. Although there was no big difference when reaction time was not longer than 10 hours, the post HHP treatment (Con-HHP) group showed high values when reaction time exceeded 15 hours. In the results of measurement of RVA pasting properties, the post HHP treatment (Con-HHP) group generally showed lower pasting temperatures, higher break down, and higher peak viscosity compared to other groups. This is considered attributable to the fact that, in the hydroxypropylation process under HHP, the hydrophilic and bulky hydroxypropyl groups weakened the binding forces in the granule, the HHP treatment promoted the collapse of granules and accelerated the leaching of intra-soluble materials. The combining HHP treatment and conventional hydroxypropylation is expected to be utilized in the food industry as a dual modification method of starch.

Allergenicity Assessment of Recombinant Proteins Expressed in Genetically Modified Organism (GMO)

우홍배 경희대학교 생명공학원 대학원 2015 국내석사

The expressed proteins of AAD-1, AAD-12, DMO, CSR1-2, CspB, Pj.D6D, and NcFAD3 in Escherichia coli was used for in vitro evaluation of simulated gastric or intestinal fluids. Seven genes (aad-1 in GM maize DAS 40278-9, aad-12 in GM maize DAS 44406-6, dmo in GM soybean MON87708, csr1-2 in GM soybean CV127, cspB in GM maize MON 87460, pj.d6d, and nc.fad3 in GM soybean MON87769) cloned into pET vectors. The cloned plasmid DNAs were transformed into E.coli BL21 (DE3), and then genes were over-expressed under IPTG induction. The target proteins except Pj.D6d and Nc.FAD3 were purified by affinity chromatography. The Pj.D6D and Nc.FAD3 were extracted directly from SDS-PAGE gel. The allergenicity of purified proteins was assessed by the digestibility assay in vitro simulated gastric fluid (SGF), and simulated intestinal fluid (SIF). As a result, the proteins were rapidly digested in SGF and SIF, these proteins were regarded as low allergenic potential. It means extremely low probability of being absorbed by epithelial cells of the stomach and small intestine in a biologically active form.