Xenopus laevis 유생에서 프탈레이트 가소제의 내분비교란효과 = Endocrine disruption by phthalate plasticizers in Xenopus laevis tadpoles

국문 초록 (Abstract)

프탈레이트 가소제는 일상생활에 사용되는 다양한 플라스틱 제품에 광범위하게 사용되는 물질이며 생산량이 많기 때문에 대기, 지표, 하수 배출 등을 통하여 환경으로 확산되고 축적된다. 본 연구에서는 프탈레이트 가소제인 DEHP, DINP 및 대체제인 DOTP, DINP, DEHCH, DINCH에 대해 Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus (FETAX)를 사용하여 발생 독성을 확인하였고 프탈레이트 가소제에 의한 내분비교란을 확인하였다. 처리한 프탈레이트 가소제의 모든 농도에서 생존율 저하 및 기형 유도는 확인되지 않았다. 1μM DEHP, 1000μM DOTP, 100μM DINP, 1000μM DEHCH에서 올챙이의 성장률이 감소하였으며, 100μM DPHP, 1000μM DINCH, 1μM DINP, 1μM DEHCH 및 10nM E2에서는 올챙이의 성장률이 증가했다. 살아남은 올챙이에서 프탈레이트 가소제의 내분비교란효과를 조사한 결과 DEHP, DOTP, DPHP, DINP, DEHCH, DINCH는 각각 10μM, 1μM, 10μM, 10μM, 10μM, 1μM에서 에스트로겐성 바이오마커인 vtg mRNA 발현을 증가시켰으며 E2는 1nM에서 vtg mRNA 발현을 증가시켰다. 프탈레이트 가소제에 의한 vtg mRNA 발현 증가는 ICI에 의해 억제되었다. vtg 전사 유도 경로를 확인하기 위하여 NF stage 45 올챙이 간과 성체 암컷 간에서의 에스트로겐 수용체 발현을 조사했다. ERα는 성체 암컷 간에서 발현이 높았으며 ERβ는 정상 NF stage 45 올챙이 간에서 발현이 높았다. 1000nM E2에 노출된 올챙이 간에서 vtg 및 ERα mRNA 발현이 증가하였고 이는 10nM ICI에 의해 억제되었다. ERα agonist인 PPT에 의해 vtg와 ERα mRNA 발현이 증가하였고 ERβ agonist인 DPN에 의해서는 vtg, ERα 및 ERβ mRNA 발현이 증가하였다. 10μM DEHP, 1μM DOTP, 1μM DPHP, 1μM DINP, 1μM DEHCH, 1μM DINCH에 노출된 NF stage 45 올챙이 간에서 ERα mRNA 발현이 증가하였고 프탈레이트 가소제에 의한 ERα mRNA 발현 증가는 ICI에 의해 억제되었다. 1000μM DOTP, 1μM DPHP, 1000μM DINP, 1000μM DEHCH, 100μM DINCH에 노출된 올챙이 간에서 ERβ mRNA 발현이 감소하였다. E2의 경우 ERα 및 ERβ mRNA 발현은 10nM, 1nM에서 증가하였고 10nM E2에 노출된 올챙이 간에서는 ERβ mRNA 발현이 감소하였다. 프탈레이트 가소제 및 E2에 의해 NF stage 45 올챙이 간에서 ERα 단백질 발현이 증가하였다. 위의 결과로부터 프탈레이트 가소제 및 대체제 노출은 양서류 유생에서 에스트로겐 수용체의 비정상적인 증가를 통해 내분비교란을 유도하는 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 재료 및 방법 3
• 2.1. 실험 재료 3
• 2.2. 실험 물질 4
• 2.3. 실험 방법 6
• 2.3.1. 발생단계 확인 (Developmental stage) 6
• 2.3.2. 젤리층 제거 (L-cysteine) 6
• 2.3.3. 배아선별 6
• 2.3.4. FETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus) 7
• 2.3.5. 개체 성장률 측정 7
• 2.3.6. 기형개체 판별 8
• 2.3.7. 간 조직 샘플링 8
• 2.3.8. RNA 분리 8
• 2.3.9. Reverse Transcription (RT) 10
• 2.3.10. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 10
• 2.3.11. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) 10
• 2.3.12. 단백질 분리 12
• 2.3.13. Western blot 12
• 2.3.14. Embedding 및 Paraffin block 제작 13
• 2.3.15. Immunohistochemistry (IHC) 13
• 2.3.16. Statistical Analysis 14
• III. 결과 15
• 3.1. 농도별 phthalate 처리에 따른 배아의 발생독성 15
• 3.2. 농도별 phthalate 처리에 따른 배아의 성장률 19
• 3.3. 농도별 phthalate 처리에 따른 배아의 기형률 22
• 3.4. 농도별 phthalate 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간의 vitellogenin 유전자 발현 26
• 3.5. 암컷 Xenopus laevis 간과 NF stage 45 올챙이 간의 estrogen receptor 발현 30
• 3.5.1. Estrogen receptor 유전자 발현 비교 30
• 3.5.2. Estrogen receptor 단백질 발현 비교 30
• 3.6. Estrogen receptor agonist, antagonist 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간에서의 유전자 발현 변화 33
• 3.6.1. vitellogenin 유전자 발현 변화 33
• 3.6.2. Estrogen receptor α 유전자 발현 변화 34
• 3.6.3. Estrogen receptor β 유전자 발현 변화 34
• 3.7. 농도별 phthalate 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간의 estrogen receptor 유전자 발현 38
• 3.7.1. Estrogen receptor α 유전자 발현 38
• 3.7.2. Estrogen receptor β 유전자 발현 39
• 3.8. 농도별 phthalate 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간의 estrogen receptor 단백질 발현 45
• 3.9. Phthalate에 의해 유도된 유전자의 estrogen receptor antagonist 처리에 따른 발현 변화 48
• IV. 논 의 51
• 4.1. 농도별 phthalate 처리에 따른 배아의 발생독성 51
• 4.2. 농도별 phthalate 처리에 따른 배아의 성장률 52
• 4.3. 농도별 phthalate 처리에 따른 배아의 기형률 53
• 4.4. 농도별 phthalate 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간의 vitellogenin 유전자 발현 54
• 4.5. 암컷 Xenopus laevis 간과 NF stage 45 올챙이 간의 estrogen receptor 발현 55
• 4.6. Estrogen receptor agonist, antagonist 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간에서의 유전자 발현 변화 56
• 4.7. 농도별 phthalate 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간의 estrogen receptor 발현 57
• 4.8. Estrogen receptor antagonist 처리에 따른 NF stage 45 올챙이 간의 유전자 발현 변화 59
• Ⅴ. 결론 60
• Ⅵ. 참고문헌 61
• Ⅶ. Abstract 67