다제내성 결핵균의 LC-MS 기반 단백질 프로파일링 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Abstract

Tuberculosis is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). This tuberculosis is an epidemic that has affected people for centuries and is still a major threat to global health problems. The appearance of multidrug-resistant tuberculosis has been a new obstacle to tuberculosis control. Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is caused by bacteria resistant to the anti-tuberculosis drug rifampicin and isoniazid. Treatment of MDR-TB takes longer than drug-sensitive tuberculosis, has acute side effects, and often has poor treatment outcomes, reducing treatment success rates. Furthermore, multi drug-resistant tuberculosis bacteria can progress to extensively drug resistant-tuberculosis (XDR-TB). Prevention of development of drug resistance must be accorded the top priority in MDR-/XDR-TB. Therefore, it is necessary to identify patients at high risk of treatment failure and provide appropriate treatment even before the start of the sample through a prognostic biomarker.
we performed the quantitative protein profiling using the high resolution LC-MS to discover the diagnostic biomarkers in multidrug-resistant (MDR) tuberculosis. To this end, we used the Mycobacterium of MDR-TB isolated by treatment-failure patient (5 times). In order to identify as many proteins as possible, a micro-scale basic inverse phase liquid chromatography (bRPLC) segmentation method and 3 technical replication were performed.
The total of 1453 proteins were identified and gene ontology (GO) analysis was performed to identify the functional specificity of proteins. For the screening of biomarker candidates, an ANOVA test and relative quantitation (Fold change ≥ ±2) were performed and it resulted in 404 proteins. For the analysis of functional network, K-Means clustering analysis was preformed and 5 clusters (Cluster1: 72, Cluster 2: 56, Cluster 3: 60, Cluster 4: 110, and Cluster 5: 106) were classified. Among the 5 clusters, we have focused on cluster 2&4 representing proportionally increased and decreased patterns and its signaling pathway was analyzed. As a result, cluster 2&4 was related in fatty acid synthesis and Lipid metabolism. For the selection of more reliable biomarker candidates, the correlation of Genotypic DST marks (katG, inhA, and rpoB) and biomarker candidates in cluster 2&4 was confirmed. Finally, 4 new biomarkers candidates such as pssA, nrp, cysA1, and cysA2 were selected.

국문 초록 (Abstract)

국문 요약

결핵(Tuberculosis, TB)은 마이코박테리아 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 발생하는 만성 감염성 질환이며, 수 세기 동안 사람들에게 영향을 미쳐왔으며 현재까지도 전 세계적으로 매우 위협적인 질병이다. 특히, 다제내성 결핵 (Multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)의 등장은 결핵 문제를 해결하는데 새로운 걸림돌이 되었다.
다제내성 결핵은 가장 중요한 1차 항생제인 림팜핀 (Rifampicin)과 이소나자이드 (Isoniazid)에 내성이 있는 균에 의해 발생 되며, 치료는 일반 결핵보다 시간이 오래 걸리고, 부작용 및 치료 예후도 좋지 않아 치료 성공률이 높지 않다. 더욱이 치료 실패 시 결핵균은 광범위성 결핵으로 진행될 수 있어 그 심각성이 더해지고 있다. 따라서 다제내성 결핵을 진단할 수 있는 진단 바이오마커 발굴을 통한 개인 맞춤형 치료가 필요하다.
본 연구에서는 LC-MS 기반 단백질 정량 프로파일링 기법을 활용하여 결핵의 진단 및 모니터링을 할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다. 본 연구수행을 위해 결핵을 앓고 있는 환자의 객담(약물치료 실패: 5회) 유래 결핵균을 분리하여 사용하였다. 바이오마커 발굴을 위한 단백질 프로파일링 분석을 위해, 단백질 시료의 펩타이드화를 진행하였으며, Micro-bRPLC (micro-scale basic inverse phase liquid chromatography) 방법을 사용하여 최대 펩타이드 데이터를 확보하고자 하였다. 또한, 단백질 상대-정량분석 (Relative quantitation) 분석을 위해 3 반복의 LC-MS 분석을 진행하였다.
본 연구결과, 총 3,090개의 단백질을 동정하였고, Gene Ontology 분석을 통해 각 결핵균의 주요 단백질의 생물학적 기능에 대해서 확인하였다. 결핵의 진단을 위한 바이오마커 후보선별을 위해 5개 그룹의 상대정량 (Relative quantitation)분석을 진행하였다. 1차로, 정량 가능한 1,453개의 단백질을 확인 후, ANOVA 테스트를 통해 그룹 간 차이를 보이는 810개의 단백질을 선별하였고, 2차로 발현 차이 (Fold change ≥ ±2)를 보이는 404개의 단백질을 선별하였다. 선별된 단백질의 기능적 네트웍 분석을 위해 K-Means Clustering 분석을 수행하였으며, 총 5개의 Cluster (Cluster1: 72, Cluster 2: 56, Cluster 3: 60, Cluster 4: 110, Cluster 5: 106)가 분석되었다. 분석된 5개 Cluster 중 단계적 증가 및 감소 추세를 보이는 Cluster 2&4의 주요 Signaling pathway 분석을 수행하였으며, 그 결과 주로 지방산 및 지질 생합성 관련 pathway와 관련된 것을 확인하였다. 보다 엄밀한 후보 마커 선별을 위해, 유전자형 검사의 주요 마커 (katG, inhA, rpoB)와의 연관성에 대해서 분석하였으며, 최종 4종 (pssA, nrp, cysA1, cysA2)의 결핵 진단 후보 마커를 선별하였다. 향후 선별된 후보 마커의 검증을 위하여, 대량 시료 분석을 통한 통계적 검증연구를 추가로 계획하고 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 5
• 1. 결핵균 배양 및 추출 5
• (1) 검체 (객담) 속 결핵균 분리 및 배양 5
• (2) 약물 감수성 시험 (Drug susceptibility Test, DST) 5
• (3) 윤리적 승인 6
• 2. 분석 방법 8
• (1) 결핵균 용해 및 단백질 추출 8
• (2) In-solution digestion 9
• (3) Micro-scale basic reverse phase liquid chromatographic (bRPLC)기법을 이용한 펩타이드 분획 10
• (4) LC-MS 분석 (액체 크로마토그래피-질량 분석) 13
• (5) Data 분석 (단백질의 확인 및 상대 정량) 17
• Ⅲ. 결 과 20
• 1. 객담 유래 결핵균의 프로테옴 확인 20
• (1) LC-MS 분석 결과 20
• (2) 동정된 결핵균 단백질 확인 31
• (3) 전체 확인된 결핵균 단백질의 Gene Ontology 분석 34
• 2. 진단 바이오마커 선별을 위한 상대정량분석 37
• (1) Label free quantitation (Differentially expressed proteins) 37
• (2) K-means clustering 분석 39
• (3) Signaling pathway 분석 41
• 3. 선별된 후보 진단 바이오마커 확인 48
• (1) 기존 진단 바이오마커 3종 (katG, inhA, rpoB) 확인 48
• (2) 진단 바이오마커 후보군 선별 50
• Ⅳ. 고 찰 52
• 참고 문헌 55
• 국문 요약 65