A study on the transgenic rice overexpressing Arabidopsis fatty acid desaturase 7 gene = Arabidopsis의 fatty acid desaturase 7 유전자를 과다 발현시킨 형질전환 벼에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

ω-3 fatty acid desaturase는 linoleic acid를 linolenic acid로 전환을 촉매시키는 막 결합 효소이며, 미소체와 엽록체 막에 위치하고 있다. 벼 종자의 배로부터 유래된 calli를 플라스미드 pCAMBlA1380을 가지고 있는 Agrobacterium tumefciens균주인 LBA4404와 공조 배양하였다. 플라스미드pCAMBIA1380은 선발 유전자로 hygromycin 유전자를, 비선발 유전자는 Arabidopsis thaliana(AtFAD7)로부터 가져온 fatty acid desaturase 유전자를 가지고 있으며, 재분화 과정동안 hygromycin으로 선발하였다. 형질전환의 결과 19개의 독립적인 벼를 얻었으며, 이러한 형질전환 벼는 대조구보다 더 생육이 느리며 종자 수확량이 적었다. 형질전환체 19개중 7개를 선발하여 southem hybrization, northern hybridization, 그리고 다음 세대로의 종자 유전 분석뿐 아니라 저온 저항성 실험을 하였다. southern hybridization 분석 결과 외래 유전자가 모두 형질전환체로 삽입되었음을 알 수 있었고 mRNA의 발현도 확인할 수 있었다. 그리고 형질전환체의 지방산 분석 결과 기대와 다르게 18:3함량이 대조구보다 감소되는 경향을 보였다. hygromycin 저항성 분석 결과로는 모든 형질전환체가 hygromycin 100mg/L 용액에 저항성이 있음을 알 수 있었다. 저온 저항성 실험을 위해서 5℃ 에 48시간 처리하여 malondialdehyde 함량을 분석한 결과 대부분의 형질전환체에서 MDA의 함량이 대조구보다 더 낮게 나타났다. 그 결과 F1, F10 계통에서는 대조구보다 저온에 저항성을 나타내었으나 F2, F12 계통에서는 대조구와 유사하게 나타났다. α-linolenic acid는 식물에서 상처에 유도된 유전자의활성에 관여하는 식물 생장 조절제인 jasrmonic acid의 전구체로 이용되기도 한다. 따라서 T₁세대의 형질전환체와 대조구를 가지고 상처를 처리한 것과 상처 처리하지 않은 잎의 jasmonic acid 함량을 분석하였다. 상처 처리하지 않은 잎에서 대조구보다 형질전환체 모두에서 JA 함량이 더 높게 나타났으며, 상처 처리한 잎의 JA 함량 또한 형질전환체에서 높게 증가됨을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The ω-3 fatty acid desaturases are membrane-bound enzymes catalyzing the conversion of linoleic acid to linolenic acid in lipids, and are located both in the microsome and plastid envelopes as two different isoforms. Calli induced from embryos of mature rice seeds were co-cultivated with A. tumefaciens strain LBA4404 harboring the plasmid pCAMBIA1380 as a selectable marker gene, hygromycin, and an un selectable gene, fatty acid desaturase gene from Arabidopsis thuliana (AtFAD7), then confirmed hygromycin selection followed by an efficient regeneration system. As the result of transformation, 19 individual lines were produced. This transgenic plant grew more slowly and produced less seeds than the wild-type plant. Southern hybridization, northern hybridization, and inheritance of these genes were analyzed as well as cold resistance test with seven out of 19 in the transgenic plants. Data from southern hybridization analysis proved that foreign genes on T-DNA were stably integrated into the rice genome at low copy numbers. Northern-blot analysis revealed that seven transgenic rice plants expressed AtFAD7 mRNA. Contrary to expectation, the transformants with the fad7 gene decreased 18:3 contents then that of the wild-type. The result of hygromycin resistant analysis was showed that all the transgenic lines were resistant 100mg/L hygromycin solution. Chilling injury was assessed their malondialdehyde (MDA) contents. Chilled wild type plant had a higher malondialdehyde (MDA) contents in leaves than chilled transgenic plants. The results suggest that the transgenic plants, F1, F10 expressing AtFAD7 gene, has resistant at the cold than the wild type, but F2, F12 were similar to wild type. α-Linolenic acid is a precusor of jasmonic acid, a plant growth regulator involved in the control of wound-indeced gene activation in plants. The JA contents of T₁ transgenic and wild-type plants were analyzed with unwounded and wounded leaves. The JA levels of all transformants were higher than that of the wild-type in unwounded leaves also the JA levels of F2 and F12 were highly increased in wounded leaves.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• ABSTRACT = 1
• INTRODUCTION = 3
• MATERIALS AND METHODS = 7
• 1. Plasmid Construction = 7
• 2. Plant Materials = 9
• 3. Transformation and Regeneration = 9
• 4. Southern Blot Analysis = 11
• 5. Northern Blot Analysis = 11
• 6. Hygromycin Resistant Analysis = 11
• 7. T1 Inheritance = 11
• 8. Fatty Acid Composition Analysis = 12
• 9. Cold Treatment and MDA Measurement = 13
• 10. JA Analysis = 13
• RESULTS AND DISCUSSION = 14
• 1. Rice Transformation and Regeneration = 14
• 2. Southern Blot Analysis = 18
• 3. Northern Blot Analysis = 19
• 4. Hygromycin Resistance Analysis = 20
• 5. Segregation of the T1 Generation = 21
• 6. Fatty Acid Analysis of the Transgenic Plants = 22
• 7. Cold Treatment and MDA Measurement = 23
• 8. JA measurement = 24
• REFERENCES = 25
• ABSTRACT IN KOREAN = 30