무 지지세포 (feeder-free) 환경에서 히스톤 탈아세틸효소 저해제들을 이용한 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포의 배양방법 = The Feeder-free Culture of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells in the Presence of Histone Feacetylase Inhibitors

국문 초록 (Abstract)

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell ; hESC)는 미분화 상태를 유지하며 무한 증식할 수 있는 능력과 인체의 모든 조직과 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있다. 이러한 특성을 활용하여 다양한 종류의 세포로 분화를 통해 질병치료를 위한 치료제로써의 가능성을 가지고 연구가 활발히 진행되고 있다.
최근 인간만능줄기세포, 즉 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포들을 특정 세포로 분화시켜 신약 스크리닝이나 치료제 효능평가, 혹은 독성평가의 세포모델로 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행이 되고 있다. 이러한 세포모델들은 기존의 방법에 의해 소모되었던 과도한 시간, 비용, 과 인력을 줄일 수 있는 기회를 제공해 주고 있다.
전통적으로 인간 배아줄기세포의 배양은 일반적으로 생쥐 배아섬유세포(mouse embryonic fibroblast)와 같은 동물유래 지지세포 위에 세포를 배양한다. 하지만, 지지세포를 사용하는 경우 신약 스크리닝이나 효능 및 독성평가 시 지지세포의 변형에 기인한 실험결과 분석 상의 오류를 유발할 가능성이 매우 크기 때문에 극복해야 할 문제가 되어왔다. 또한 고속대량 스크리닝 (high-throughput screening)시 지지세포 접종은 시간, 비용, 노력이 많이 들게 하고 실험결과의 신뢰도에 영향을 많이 주게 된다. 본 연구에서는 히스톤 탈아세틸효소 저해제(histone deacetylase inhibitors)들을 이용한 후성학적인 조절(epigenetic control)을 통해 무지지세포 하에서도 인간만능줄기세포를 배양할 수 있는 배지를 조성하고 이들의 배양효능을 분석하는데 초점을 맞추었다. 대표적인 히스톤 탈아세틸화 저해제인 Sodium butyrate, Valproic acid, Trichostatin A를 사용 했을 때 비슷한 효율을 보였으며, 점착률과 성장속도에 있어서도 배양되어 안정적인 배양을 할 수 있었다. 배양된 배아줄기세포는 면역형광 염색과 유전자 발현에서도 미분화와 분화가 잘 유지되고 있음을 확인하였고, 안정적인 배양으로 적합하다는 것을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Human pluripotent stem cells (hPSCs) such as human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (hiPSCs) retain the capacity to self-renew and differentiate into cells of all three germ layers of the body. These unique properties of hiPSCs make them an ideal cell source for cell-replacement therapies to treat many incurable diseases. Conventionally, hESCs have been cultured on feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts (MEFs) which often ham-per successful genetic modification or screening of small molecules. In the previous study, we reported that sodium butyrate, a histone deacetylase inhibitor (HDACi), can replace basic fibroblast growth factor in culture of hESCs using MEFs as feeder cells. However, the effects of HDACis in a feeder-free culture condition were yet to be investigated. Here we set out to explore whether various HDACIs played any role in culture of hPSCs without differentiation. We found that the three commonly used HDACis, sodium butyrate, valproic acid, and trichostatin A supported undifferentiated growth of hESCs and hiPSCs efficiently. In addition, the HDACi-containing culture media also supported stable cell attachment to the bottom of vitronectin-coated dishes during each passage. The expanded hPSCs were shown to express undifferentiation markers at a significant level, while the expression of three germ layer markers was very low. Karyotyping analysis revealed no abnormal change in the chromosomes after culture of hPSCs in these HDACi-containing media. Taken together, our results suggested that HDACis can be useful to design media that can support undifferentiated growth of hPSCs in the absence of feeder cells.

Keywords : human embryonic stem cells, human induced pluripotent stem cells,
feeder-free culture, histone deacetylase inhibitor

목차 (Table of Contents)

• I.서론 1
• II. 재료 및 방법 3
• 1. 세포주 및 배양 배지 3
• 2. EB(Embryoid Body)로의 분화 배지 및 방법 3
• 3. 계대배양 시 미분화율 측정 3
• 4. Alkaline Phosphatase 염색 4
• 5. 형광 면역염색(Immunostaining) 4
• 6. qRT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석방법 5
• 7. 콜로니들의 크기와 개수 측정 6
• 8. 핵형 분석(Karyotyping) 7
• III. 결과 및 고찰 8
• 1. 지지세포를 사용하지 않고 히스톤 탈아세틸효소 저해제를 이용한 인간배아줄기세포와 유도만능줄기세포의 배양 8
• 2. 히스톤 탈아세틸효소 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 인간만능줄기세포의 증식효율 비교 11
• 3. 히스톤 탈아세틸효소 저해제를 첨가한 배지에서 배양된 인간만능줄기세포에서의 미분화 및 분화 표지(marker)들의 발현여부 14
• 4. 히스톤 탈아세틸효소 저해제를 첨가한 배지에서 배양된 인간만능줄기세포에서의 분화능 분석 20
• 5. 핵형분석(karyotyping) 23
• IV. 결론 25
• 참고문헌 27
• 영문요약 30