전립선암 세포주에서 새로운 합성물질인 니코티나마이드 유도체들의 항안드로겐 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The androgen？Vandrogen receptor (AR) system plays an important role in the development and progression of prostate cancers. Therefore, hormonal therapies, mainly with combinations of anti-androgens and androgen deprivation, have been the mainstay treatment for prostate cancer. However, emergence of androgen resistance largely due to inefficient anti-hormone action limits their therapeutic usefulness. Here I report that nicotinamide derivatives act as novel anti-androgenic compounds. To screen novel compounds for anti-androgen, I initially performed flexible docking with FlexX on a chemical library containing 200,000 drug-like molecules extracted from commercial and in-house databases using X-ray structure of AR ligand binding domain with testosterone derivative, metribolone. Fifty-four novel synthetic compounds were selected through the hit selection process, which is based not only on potency and novelty, but also on all other parameters that subsequently influence the successful outcome of the lead optimization phase. Putative anti-androgenic compounds among them were then screened through cell-based screening for AR antagonist. The AR agonist and antagonist activities of fifty-four compounds were determined by the ability of each compound to regulate AR-mediated transcriptional activation in cultured COS-7 cells by transient transfection assays. Four compounds, Compound #1 (DIMN), #7, #8, and #17, were selected as putative anti-androgens, and their selective activity for AR was confirmed by their ability to inhibit AR-, GR-, or ER-mediated transactivation. Only one compound, DIMN, showed an inhibitory activity on the AR-mediated transcriptional activation in a dose-dependent manner. Then, I composed and tested 40 derivatives of nicotinamide, and selected 16 derivatives that had a strong inhibitory activity on the AR-mediated transcriptional activation. In particular, DIMN or D-7 strongly down-regulated the protein expression levels of AR target genes, prostate-specific antigen (PSA) and NKX3.1 in LNCaP or C4-2 prostate cancer cells. Interestingly, the compounds also decreased the protein level of AR. The action mechanism of nicotinamide derivatives as anti-androgens were analyzed by performing ligand competition assays, which revealed 50% inhibition of [3H] 5？\-dihydroxytestosterone (DHT) binding to the AR at approximately 1~2 ？？M of DIMN and 10 ？？M of D7, respectively. In addition, protein localization analyses using GFP-AR fusion protein showed that DIMN inhibited AR nuclear translocation to the similar extent of the AR antagonist BIC. However, DIMN and nicotinamide derivatives, D-7, and D-38, had little inhibitory effect on AR recruitment onto the PSA enhancer region containing AR binding sites. Interestingly, D-40 enhanced AR recruitment onto PSA enhancer region in some extent. I also tested the effects of DIMN and nicotinamide derivatives on the action of AR coactivators, SRC-1 and SRC-2 because the elevated expression of SRC-1 and SRC-2 has been reported to enhance AR activity in the development of more aggressive prostate cancer. The results revealed that DIMN and D-7 inhibited the SRC-1- and SRC-2-mediated enhancement of AR transactivation. In the case of D-38 and D-40, their effects on SRC-1 and SRC-2 action were unable to be addressed because of their complete blocking of DHT-activated AR transactivation. Unexpectedly, DIMN seemed to inhibit the steroidogenesis in Leydig cells, lowering the levels of progesterone and testosterone in culture media of rat R2C cells, in a similar extent to BIC, although the molecular mechanism for this effect are not known. Finally, consistent with their anti-androgenic activity, DIMN and nicotinamide derivatives inhibited the growth of LNCaP and C4-2 cells in a dose-dependent manner, while the compounds showed no cytotoxic effect on MEF cells as normal cells. Taken all together, these results suggest that DIMN and nicotinamide derivatives could be a useful chemopreventive and chemotherapeutic agent for prostate cancer.

국문 초록 (Abstract)

남성호르몬의 작용 매개자인 남성호르몬 핵수용체는 리간드 의존적 전사인자로 세포에서 표적유전자들의 발현조절을 통하여 세포기능을 조절한다. 전립선에서 안드로겐 수용체 (androgen receptor, AR)는 정상적인 전립선의 발달뿐 아니라 전립선암의 발생 및 전이에도 중요한 역할을 하기 때문에, 항안드로겐과 세포 내 안드로겐의 농도를 낮추는 호르몬요법으로 전립선 암 치료를 하게된다. 그러나 호르몬 요법이 실패할 경우 안드로겐 의존적인 성장에서 안드로겐 비의존적인 성장을 나타내게 됨에 따라 내성이 생기게 되어 치료가 불가능한 암으로 되는 문제점이 있다. 그래서 나는 전립선암 세포주에서 항안드로겐으로 작용하는 새로운 합성물을 찾아내고, 그 물질들이 항안드로겐으로 작용하는 분자생물학적인 기전에 대해서 연구하였다. 첫째로, 구조를 기반으로한 virtual screening을 통해 항안드로겐으로 작용할 수 있는 물질을 선별하였다. 둘째로, 앞서 FlexX docking modeling을 통해 선별된 54개의 합성물은 cell-based screening을 통해 항안드로겐 효과를 보이는 물질을 선별하였는데, 이 과정에서 compound#1, #7, #8, #17 이 선별되었으나, 오직 compound#1 (DIMN; 6-(3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-N-(6-methylpyridin-2-yl) nicotinamide) 만이 농도 의존적으로 AR 특이적으로 transcriptional activity를 저해함을 확인하였다. 다음으로, 40개의 니코티나마이드 유도체들을 더 합성하여 안드로겐 수용체의 transcriptional activity를 저해함으로써 항안드로겐 효과를 보이는 16개의 합성물을 더 찾아냈으며, 그 중에서 D-7, D-38, D-40은 안드로겐 수용체의 transcriptional activity를 강력하게 저해하였고, LNCaP 또는 C4-2 전립선암 세포주에서 DIMN과 D-7에 의해 안드로겐 수용체의 표적 유전자 (PSA, NKX3.1, TSC22D1) 발현이 저해됨을 확인하였다. Ligand competition assay를 통해 DIMN과 더불어 D-7, D-38, D-40 이 기존에 사용되어 오던 Bicalutamide (BIC) 에 비해서는 안드로겐 수용체에 대한 결합력은 떨어지나 이 합성물 모두 리간드인 DHT가 안드로겐 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해함으로써 안드로겐 수용체에 결합하는 것을 확인하였다. 또한 안드로겐 수용체가 리간드 DHT에 의해 핵으로 이동되는 것이 DIMN에 의해 저해됨을 확인하였는데, 이는 항안드로겐인 BIC와 비슷한 양상을 나타내었다. 또한 안드로겐 수용체는 리간드 DHT에 의해 표적 유전자의 promoter에의 결합이 증가하는데 이러한 효과를 니코티나마이드 유도체들 (DIMN, D-7, D-38)이 저해함을 확인할 수 있었고, 안드로겐 수용체의 coactivator인 SRC-1과 SRC-2에 의해 증가한 AR-mediated transcriptional activity 또한 저해정도에는 차이가 있으나 모두 니코티나마이드 유도체들 (DIMN, D-7, D-38, D-40)에 의해 저해됨을 확인하였다. 항안드로겐인 BIC가 정상 수컷 쥐 모델에서 혈청내 호르몬 합성에 영향을 미친다는 보고는 있었으나, rat leydig 세포주인 R2C에 DIMN를 처리한 결과 대조군 (DMSO)에 비해 호르몬 합성이 30~40% 정도 저해되었으며, 이는 BIC에 비해 비슷하거나 더 효과적으로 호르몬 합성을 저해함을 확인할 수 있었다. 마지막으로 이 유도체들을 전립선암 세포주에 처리함으로서 암 세포주의 성장을 확인한 결과 AR-positive한 전립선암 세포주 (LNCaP, C4-2)의 성장을 저해하였으며, AR-negative 한 전립선암 세포주 (PPC-1, AT3.1)의 성장에는 영향이 없음을 확인하였다. 이들 모두 항안드로겐 BIC에 비해 더 효과적으로 암 세포주의 성장을 저해하였으며, 세포독성은 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 종합해보면, DIMN을 비롯한 니코티나마이드 유도체들 (D-7, D-38, D-40) 이 분자생물학적인 기전을 통해 안드로겐 수용체의 활성을 저해함으로써 표적 유전자의 발현과 전립선암 세포주의 성장을 저해하였음을 확인할 수 있다. 그 결과 이 합성물질들이 전립선암의 치료에 있어서 유용한 후보 물질이 될 수 있다는 새로운 가능성을 제시해 주고 있다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS Ⅰ
• LIST OF FIGURES Ⅲ
• LIST OF ABBREVIATIONS Ⅴ
• ABSTRACT IN ENGLISH 1
• I. BACKGROUND 4
• II. MATERIALS AND METHODS 47
• III. RESULTS 56
• 1. Virtual Screening for AR antagonists 58
• 2. Cell based screening for AR antagonist 61
• 3. Specific antagonistic effect of compound#1 (DIMN) on the transactivation of AR 64
• 4. Inhibitory effect of nicotinamide derivatives on the transcriptional activity of AR 73
• 5. Suppression of androgen-induced AR target gene expression by nicotinamide derivatives 76
• 6. Inhibition of androgen binding to AR by nicotinamide derivatives 79
• 7. Effect of compound DIMN on dynamics of AR nuclear translocatio 81
• 8. Influence of nicotinamide derivatives on the recruitment of AR onto its target promoter 83
• 9. Inhibition of SRC-1- and SRC-2-mediated enhancement of AR transcriptional activity by nicotinamide derivatives 85
• 10. DIMN affects cellular hormone production in Leydig cells 87
• 11. Inhibition of AR-positive prostate cancer cell proliferation by nicotinamide derivatives 89
• 12. Cytotoxic effect of nicotinamide derivatives on MEF cell proliferation 93
• IV. DISCUSSION 95
• V. REFERENCES 99
• VI. ABSTRACT IN KOREAN 121